人體中也有逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程,比如端粒的復(fù)制。端粒(telomere)是染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由重復(fù)的DNA序列(TTAGGG)和核的蛋白組成,可以保護(hù)染色體末端,維持基因組完整性。端粒的末端是單鏈3'末端,形成一種緊湊的T環(huán)結(jié)構(gòu),可保持其穩(wěn)定性。其表面覆蓋著Shelterin復(fù)合物,包括TRF1(端粒重復(fù)結(jié)合因子1)、TRF2(端粒重復(fù)結(jié)合因子2)、TIN2(TRF1相互作用核的蛋白2)、RAP1(rif相關(guān)蛋白)、POT1(端粒保護(hù))和TPP1(端粒保護(hù)蛋白1)成功將人表皮干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,對(duì)比觀察不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的差異特征,結(jié)果表明人胚胎、少兒、成人皮膚來(lái)源的表皮干細(xì)胞均有端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá),其表達(dá)強(qiáng)度依次減弱。提示誘導(dǎo)和增強(qiáng)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)對(duì)維持表皮干細(xì)胞在體外自我更新和增殖能力可能具有重要意義。逆轉(zhuǎn)錄可改變RNA的信息內(nèi)容,為研究RNA功能提供基礎(chǔ)。上海miQP2反轉(zhuǎn)錄測(cè)序
逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄過(guò)程:基因的轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶催化進(jìn)行的。基因的上游具有結(jié)合RNA聚合酶的區(qū)域,叫作啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是一段具有特定序列的DNA,具有和RNA聚合酶特異性結(jié)合的位點(diǎn),決定了基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)。RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合后,在特定區(qū)域?qū)NA雙螺旋兩條鏈之間的氫鍵斷開(kāi),使DNA解旋,形成單鏈區(qū),以非編碼鏈為模板合成RNA互補(bǔ)鏈的過(guò)程就開(kāi)始了。轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)是以前面核苷酸的3′-OH為基礎(chǔ)逐個(gè)加入NTP,形成磷酸二酯鍵,使RNA逐步從5′向3′端延伸的過(guò)程。在原核生物中,因?yàn)闆](méi)有核膜的分隔,轉(zhuǎn)錄未完成即已開(kāi)始翻譯,而且在同一個(gè)DNA模板上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。電鏡下看到的羽毛狀圖形和羽毛上的小黑點(diǎn)(多聚核糖體),是轉(zhuǎn)錄和翻譯高效率的直觀表現(xiàn)。深圳miQP2逆轉(zhuǎn)錄供貨商逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的重要酶類。
RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄中模板的選擇:在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中,選擇總RNA或純化的mRNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄十分重要。mRNA雖然能提供略高的靈敏度,但總RNA經(jīng)常使用,具有較mRNA更重要的優(yōu)勢(shì)。首先,其過(guò)程需要較少的純化流程,這保證了更好的回收模板和更好的把結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為起始的細(xì)胞數(shù)。第二,避免mRNA富集步驟,為了避免不同mRNA的回收率而帶來(lái)結(jié)果偏移的可能性??傊?,在大多數(shù)的應(yīng)用中,目標(biāo)基因的相對(duì)定量比檢測(cè)的非常靈敏度更重要,因此在多數(shù)情況下,總RNA更適用。
逆轉(zhuǎn)錄的端粒復(fù)制:對(duì)于線性基因組,其滯后鏈的末端是無(wú)法完整復(fù)制的,每次約損失30-200個(gè)核苷酸(Cells.2020Feb22;9(2).)。這樣隨著細(xì)胞分裂,端粒會(huì)持續(xù)縮短,造成復(fù)制性衰老。對(duì)于大多數(shù)體細(xì)胞來(lái)說(shuō),端粒磨損是一種控制其分裂潛力的機(jī)制,但對(duì)于需要多次增殖的干細(xì)胞來(lái)說(shuō),必須設(shè)法維持端粒長(zhǎng)度。端粒酶(telomerase)可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程延長(zhǎng)端粒。端粒酶由端粒酶RNA(TERC)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)組成。TERT使用TERC作為模板,在染色體的單鏈末端合成端粒DNA的重復(fù)序列。大多數(shù)體細(xì)胞缺乏端粒酶活性,因而容易衰老。但未分化的生殖細(xì)胞,干細(xì)胞,活化的淋巴細(xì)胞和大多數(shù)疙瘩細(xì)胞具有高水平的端粒酶活性,可以克服端粒磨損并維持無(wú)限的細(xì)胞分裂。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)避免RNA樣品的過(guò)凍、過(guò)熱處理,影響逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效果。
逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)是以RNA為模板合成DNA的過(guò)程,即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。此過(guò)程中,核酸合成與轉(zhuǎn)錄(DNA到RNA)過(guò)程與遺傳信息的流動(dòng)方向(RNA到DNA)相反,故稱為逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄與反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)沒(méi)有什么區(qū)別,但是逆轉(zhuǎn)錄是某些病毒的自主行為,如逆轉(zhuǎn)錄病毒,它們?cè)谡系剿拗骷?xì)胞內(nèi)前以RNA為模板形成DNA的過(guò)程;反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過(guò)程中,人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA,并以之為模板人工合成DNA的過(guò)程。二者雖同為RNA→DNA的過(guò)程,但地點(diǎn)不同,相對(duì)性的來(lái)說(shuō),逆轉(zhuǎn)錄在體內(nèi),反轉(zhuǎn)錄在體外。逆轉(zhuǎn)錄是一種將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA的生物化學(xué)過(guò)程。重慶快速逆轉(zhuǎn)錄酶供貨商
逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉(zhuǎn)錄酶的選擇。上海miQP2反轉(zhuǎn)錄測(cè)序
逆轉(zhuǎn)錄試劑是一類普遍應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的試劑,它們可以用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA的過(guò)程,與正常的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的過(guò)程相反。逆轉(zhuǎn)錄試劑可以促進(jìn)這個(gè)過(guò)程的進(jìn)行,從而使得研究人員能夠更好地了解RNA的結(jié)構(gòu)和功能。逆轉(zhuǎn)錄試劑通常由逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液和酶的輔助因子組成。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種酶類蛋白質(zhì),它可以在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中起到關(guān)鍵的作用。緩沖液的主要作用是維持反應(yīng)體系的PH值和離子強(qiáng)度,從而保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行。酶的輔助因子(如酶抑制劑)則可以幫助研究人員減少誤差和提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。上海miQP2反轉(zhuǎn)錄測(cè)序