IdeSProtease是一種免疫球蛋白G(IgG)特異性降解酶,它能夠在IgG的鉸鏈區(qū)下方的一個特定位點進行切割,產(chǎn)生F(ab')2和Fc片段。這種酶是通過大腸桿菌(E.coli)表達系統(tǒng)重組表達生產(chǎn)的,并且經(jīng)過分子改造,使其具有更高的酶活和更廣的底物特異性。在生產(chǎn)過程中,確保IdeSProtease符合GMP(良好生產(chǎn)規(guī)范)標準,需要進行以下步驟:1.**分子改造**:通過分子生物學技術(shù)對IdeS進行改造,增強其穩(wěn)定性和比活性。2.**大腸桿菌表達系統(tǒng)**:利用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行IdeS的重組表達,確保無動物源性成分,減少病毒污染風險。3.**純化**:通過高度純化過程,確保IdeS的純度達到≥95%。4.**酶活定義**:1個酶活力單位定義為在37°C條件下,30分鐘內(nèi)酶切1μg重組單克隆IgG所需的酶量。5.**質(zhì)量控制**:每批產(chǎn)品都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制,以確保產(chǎn)品批間穩(wěn)定性和高穩(wěn)定性。6.**儲存條件**:采用適當?shù)膬Υ鏃l件,如-30℃至-10℃凍存,確保產(chǎn)品在有效期內(nèi)保持活性和穩(wěn)定性。7.**微生物學安全性檢測**:進行無菌檢測、體內(nèi)有毒物質(zhì)的檢測、抗生物質(zhì)殘留檢測、宿主細胞蛋白殘留檢測和病毒安全性檢測,確保產(chǎn)品符合微生物學安全性要求。
SpCas9蛋白(來自化膿性鏈球菌的Cas9蛋白)在基因編輯中的主要作用是作為核酸酶,能夠精確地切割目標DNA序列。以下是SpCas9在基因編輯中的幾個關(guān)鍵步驟和作用:1.**識別和結(jié)合**:SpCas9蛋白與一個單導向RNA(sgRNA)結(jié)合,形成RNP復合物。這個復合物能夠識別并結(jié)合到基因組中與sgRNA互補的特定DNA序列。2.**PAM序列識別**:SpCas9需要一個稱為原間隔子相鄰基序(PAM)的特定序列作為識別目標DNA的先決條件。對于SpCas9,這個PAM序列通常是5'-NGG-3'。3.**DNA切割**:一旦RNP復合物與目標DNA結(jié)合,SpCas9就會在PAM序列的3個堿基對的上游位置切割DNA雙鏈,產(chǎn)生一個雙鏈斷裂(DSB)。4.**引發(fā)DNA修復**:DNA雙鏈斷裂觸發(fā)細胞的DNA修復機制,包括同源定向修復(HDR)和非同源末端連接(NHEJ)。研究人員可以利用這些修復機制來插入、刪除或替換特定的DNA序列。5.**基因修改**:通過HDR,可以在斷裂的DNA兩端引入特定的DNA模板,從而實現(xiàn)精確的基因編輯。而NHEJ通常會導致小的插入或缺失(indel),這可以用來產(chǎn)生基因的敲除或敲入。6.**提高編輯效率**:為了提高SpCas9的編輯效率,研究人員可能會使用優(yōu)化的sgRNA設(shè)計、蛋白質(zhì)工程或嵌合融合蛋白等策略。
NLS-Cas9-EGFPNuclease在基因編輯中提高特異性的策略包括:1.**核定位信號(NLS)**:NLS有助于Cas9蛋白快速定位到細胞核,這可以減少Cas9在細胞質(zhì)中的非特異性結(jié)合,從而降低脫靶效應。2.**瞬時表達**:由于NLS-Cas9-EGFPNuclease是作為蛋白質(zhì)直接遞送的,它在細胞內(nèi)不會經(jīng)歷長時間的表達,這限制了Cas9的活性時間窗口,減少了長時間存在導致的脫靶風險。3.**優(yōu)化gRNA設(shè)計**:精心設(shè)計的gRNA可以提高特異性,通過選擇與目標基因特異性匹配的gRNA,可以減少Cas9在非目標位點的切割。4.**使用高保真Cas9變體**:一些Cas9變體被設(shè)計為具有更高的特異性,通過突變Cas9蛋白的某些氨基酸,可以降低其在非目標位點的活性。5.**熒光標記(EGFP)**:EGFP標簽不僅用于追蹤和分選,還可以幫助研究者通過熒光激起細胞分選(FACS)富集成功編輯的細胞,從而提高編輯特異性。6.**體外驗證**:在實際進行體內(nèi)基因編輯之前,可以通過體外DNA切割實驗驗證gRNA的特異性和效率,篩選出比較好的gRNA。7.**使用PAM序列優(yōu)化**:通過選擇具有限制性PAM序列的gRNA,可以減少可能的脫靶位點。
EndoS糖苷內(nèi)切酶S在抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)研究中的應用主要體現(xiàn)在糖鏈定點偶聯(lián)技術(shù)上。通過上海藥物所的研究,開發(fā)了一種新穎的糖鏈定點ADC制備策略,利用EndoS2這種糖苷內(nèi)切酶,可以將小分子細胞毒藥物“一步”定點連接到抗體的糖基化位點,實現(xiàn)了糖鏈定點ADC化合物的制備。定點偶聯(lián)技術(shù)相比傳統(tǒng)的隨機偶聯(lián)具有更好的方法指數(shù),能夠提高ADC的均一性和穩(wěn)定性,是當前ADC領(lǐng)域的研究熱點之一。在抗體的Fc結(jié)構(gòu)域N297位,這是一個保守的糖基化位點,通過在該位點引入細胞物質(zhì),可以形成具有優(yōu)勢的糖鏈定點ADC化合物(glycosite-specificADCs,gsADCs)。此外,EndoS2對多樣化的LacNAc修飾顯示出良好的兼容性,能夠高效獲得功能修飾的糖工程抗體,并且可以用于抗體的內(nèi)吞成像研究及糖鏈延伸等功能化研究。研究人員通過這種“一步”制備策略得到的糖鏈定點ADC化合物,在結(jié)構(gòu)均一性、親水性、體外穩(wěn)定性以及體外活性方面表現(xiàn)良好,并且在體內(nèi)瘤抑制活性方面,相比陽性對照ADC化合物,在低載藥量的情況下具有更強的抑制效果。EndoS酶的這些應用,不僅展示了其在簡化ADC制備流程中的潛力,還有助于推動定點ADC藥物的深入發(fā)展,為未來的生物藥物開發(fā)提供了新的思路和方法。UDG在結(jié)構(gòu)上屬于單功能DNA糖基化酶,它通過沿著DNA鏈滑動,識別尿嘧啶分子,進行堿基切除。
提高SpCas9蛋白在基因編輯中的特異性和效率是CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵。根據(jù)新的研究進展,以下是一些提高SpCas9特異性和效率的策略:1.**工程化改造**:通過定向進化和蛋白工程的方法,研究人員可以對SpCas9進行改造,以提高其在細胞中的基因編輯活性。例如,JenniferDoudna團隊開發(fā)的工程化iGeoCas9,通過在WED結(jié)構(gòu)域引入突變,顯著提高了基因編輯效率,比野生型GeoCas9高出100倍以上。2.**優(yōu)化gRNA設(shè)計**:合理設(shè)計的gRNA可以提高Cas9的特異性,減少脫靶效應。研究人員通過生物信息學工具和實驗驗證,篩選出與目標DNA序列互補性更強且特異性更高的gRNA。3.**使用高保真Cas9變體**:研究人員開發(fā)了高保真Cas9變體,這些變體在保持編輯活性的同時,降低了脫靶風險。例如,通過突變Cas9蛋白的關(guān)鍵氨基酸殘基,可以減少其在非目標位點的切割活性。4.**PAM序列的優(yōu)化**:通過改變Cas9蛋白的PAM序列識別能力,可以擴大其靶向范圍,從而提高編輯效率。例如,開發(fā)能夠識別非典型PAM序列的Cas9變體。5.**遞送系統(tǒng)的優(yōu)化**:使用核糖核的蛋白(RNP)復合物的形式遞送Cas9和gRNA,可以提高Cas9蛋白的穩(wěn)定性和編輯效率。這種方法避免了mRNA或質(zhì)粒遞送可能引起的免疫反應。Multiplex Probe qPCR Mix 是一種濃縮預混液,含有抗體技術(shù)修飾的熱啟動酶Hotstart Taq DNA聚合酶。N-Formyl-Met-Leu-Phe
牛痘DNA拓撲異構(gòu)酶I是TOPO克隆技術(shù)的關(guān)鍵組分,該技術(shù)允許快速、簡便地將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體中。Recombinant Biotinylated Human IL-5 Protein,His-Avi Tag
PreScissionProtease(PSP)是一種在蛋白質(zhì)純化和分析中使用的酶,具有以下特點:1.**特異性識別**:PSP能在低溫(4°C)下特異性識別八肽序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro或五肽序列Leu-Phe-Gln-Gly-Pro,并在Gln和Gly之間進行酶切。2.**應用**:PSP常用于去除融合蛋白中的GlutathioneS-transferase(GST)、His等標簽,有助于純化目的蛋白。3.**純度高**:PSP的純度達到95%以上,確保了實驗的準確性和重復性。4.**穩(wěn)定性好**:PSP在含有50%甘油的儲存緩沖液中,-80℃長期儲存,有效期2年;小量分裝-20℃保存,有效期6個月。5.**酶活定義**:在5℃條件下反應16小時,能夠切割100μg的GST標簽蛋白達90%以上所需的酶量定義為一個活性單位。6.**兼容性強**:PSP的酶切體系中可以兼容1%TritonX-100、Tween-20或NP-40,10mMEDTA和500mMNaCl。7.**注意事項**:某些化合物如100mMZnCl2、4mMAEBSF和100μMChymostatin會抑制PSP的酶活性50%以上。8.**優(yōu)化酶切效率**:建議進行預實驗摸索實驗濃度,實際操作中,建議酶用量1:25-1:100U/μg融合蛋白。Recombinant Biotinylated Human IL-5 Protein,His-Avi Tag