Recombinant Human Leptin Protein

EndoS糖苷內(nèi)切酶S（Endo-S）的特異性主要體現(xiàn)在其對(duì)糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的識(shí)別和切割能力上。以下是Endo-S的一些關(guān)鍵特異性特點(diǎn)：1.**糖鏈識(shí)別**：Endo-S能夠特異性識(shí)別糖鏈結(jié)構(gòu)中的某些特定序列或結(jié)構(gòu)，尤其是N-連接糖鏈的殼二糖重要結(jié)構(gòu)。2.**切割位點(diǎn)**：Endo-S在糖鏈的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，通常是在N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和天冬酰胺之間的β-N-糖苷鍵。3.**不影響抗原性**：Endo-S的切割位點(diǎn)選擇性高，不會(huì)破壞糖蛋白的抗原決定簇，因此在某些應(yīng)用中可以保持糖蛋白的免疫原性。4.**應(yīng)用多樣性**：Endo-S可以用于多種糖蛋白的去糖基化，包括抗體和其他具有N-連接糖鏈的蛋白質(zhì)。5.**研究和藥物開(kāi)發(fā)**：在研究糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能時(shí)，Endo-S提供了一種工具來(lái)研究糖鏈對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響。此外，在藥物開(kāi)發(fā)中，Endo-S用于制備糖鏈定點(diǎn)ADC化合物，通過(guò)精確控制藥物與抗體的連接點(diǎn)，提高藥物的療效和減少副作用。6.**兼容性**：Endo-S對(duì)多樣化的LacNAc修飾顯示出良好的兼容性，可以接受不同生物正交基團(tuán)、熒光基團(tuán)等衍生物作為底物，實(shí)現(xiàn)抗體糖基化修飾。7.**高效性**：Endo-S在催化糖鏈轉(zhuǎn)移或切割反應(yīng)中表現(xiàn)出高效性，有助于實(shí)現(xiàn)高效獲得功能修飾的糖工程抗體。E2酶接收來(lái)自E1的激起泛素，并在E3酶的協(xié)助下將泛素分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。Recombinant Human Leptin Protein

確保N末端His標(biāo)簽的泛素蛋白在實(shí)驗(yàn)中的活性和穩(wěn)定性，需要考慮以下幾個(gè)關(guān)鍵因素：1.**儲(chǔ)存條件**：按照生產(chǎn)商的建議，將重組泛素蛋白凍干粉儲(chǔ)存在-25~-15℃的條件下，以保持其穩(wěn)定性和活性。2.**避免反復(fù)凍融**：多次凍融會(huì)降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和活性。建議在使用后將剩余的蛋白質(zhì)分裝并儲(chǔ)存在推薦的條件下。3.**復(fù)溶條件**：按照產(chǎn)品說(shuō)明，使用無(wú)菌蒸餾水或推薦的緩沖液將蛋白質(zhì)復(fù)溶至適當(dāng)?shù)臐舛?。通常建議添加0.1%BSA以增加蛋白質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性。4.**使用前離心**：在使用前，將蛋白質(zhì)溶液短暫離心，以確保所有組分都沉積在底部，避免取樣時(shí)的不均勻性。5.**工作濃度和體積**：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將蛋白質(zhì)稀釋至工作濃度，并盡量使用小體積以減少蛋白質(zhì)的降解。6.**避免蛋白降解**：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用蛋白酶抑制劑以防止蛋白降解酶對(duì)重組泛素蛋白的降解。7.**避免氧化**：在蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存和使用過(guò)程中，避免氧化，可以通過(guò)添加抗氧化劑如DTT或TCEP。8.**避免污染**：使用無(wú)菌技術(shù)操作，確保實(shí)驗(yàn)器材和環(huán)境的清潔，避免微生物污染。9.**操作環(huán)境**：在4℃或冰上進(jìn)行操作，以減少蛋白質(zhì)降解和非特異性相互作用。Recombinant Human PTH1-84由于Pfu DNA Polymerase 對(duì)引物的質(zhì)量要求較高，使用純度高的引物可以減少由于引物錯(cuò)誤導(dǎo)致的非目標(biāo)突變。

PreScissionProtease（PSP）在去除融合蛋白標(biāo)簽時(shí)，對(duì)目的蛋白的純度和活性的影響通常是積極的，具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1.**小化污染**：由于PSP具有高度的特異性，它在特定的肽鍵處切割，從而減少了非特異性切割可能導(dǎo)致的蛋白質(zhì)片段，這有助于保持目的蛋白的純度。2.**減少蛋白質(zhì)修飾**：PSP的特異性切割有助于避免在切割過(guò)程中對(duì)目的蛋白引入額外的修飾，如磷酸化或糖基化，這些修飾可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性。3.**保持活性**：如果融合蛋白標(biāo)簽的設(shè)計(jì)和切割位點(diǎn)選擇得當(dāng)，PSP切割后的目的蛋白通常能夠保持其原有的生物活性。切割位點(diǎn)通常位于標(biāo)簽和目的蛋白之間，這樣切割后不會(huì)在目的蛋白上留下額外的氨基酸，從而減少了對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。4.**提高純度**：PSP切割后，可以通過(guò)親和層析等方法將標(biāo)簽、PSP以及未切割的融合蛋白分離，從而獲得高純度的目的蛋白。5.**便于后續(xù)分析**：去除標(biāo)簽后的目的蛋白更易于進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜分析、晶體學(xué)研究或其他生物化學(xué)分析，因?yàn)槿コ丝赡芨蓴_分析的標(biāo)簽部分。6.**穩(wěn)定性**：在某些情況下，融合蛋白的標(biāo)簽可能有助于穩(wěn)定目的蛋白的構(gòu)象，因此在去除標(biāo)簽后，需要適當(dāng)處理以維持目的蛋白的穩(wěn)定性。

酵母重組表達(dá)的N-糖苷酶F（PNGaseF）在實(shí)際應(yīng)用中具有以下優(yōu)勢(shì)：1.**高比活性**：具有高達(dá)750,000U/mL的比活性，這表明該酶在催化反應(yīng)中具有很高的效率。2.**快速反應(yīng)**：新型的FastPNGaseF能在數(shù)分鐘內(nèi)完成徹底且無(wú)偏好性的去糖基化，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。3.適用性：PNGaseF可以用于天然或變性條件下的糖蛋白或糖多肽的去N-糖基化修飾。4.**無(wú)其他糖苷酶活性**：該酶專一性高，無(wú)其他糖苷酶活性，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.**His標(biāo)簽**：帶有His標(biāo)簽，便于通過(guò)親和層析進(jìn)行純化和檢測(cè)。6.**穩(wěn)定性和儲(chǔ)存條件**：在含有50%甘油的儲(chǔ)存緩沖液中，-15~-25℃保存，有效期長(zhǎng)達(dá)1年。7.**簡(jiǎn)化的實(shí)驗(yàn)流程**：FastPNGaseF簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)保持了靈敏度和重復(fù)性。8.**兼容性好**：去糖基化后的產(chǎn)物可以直接用于下游的色譜或質(zhì)譜分析，無(wú)需額外的純化步驟。9.**無(wú)偏好性**：能夠迅速且無(wú)偏好性地去除所有的N-糖鏈，確保了獲得的糖鏈分布能夠表示抗體的正確組成。泛素蛋白的C末端通常通過(guò)酰胺鍵與靶蛋白的氨基團(tuán)連接在一起，最常見(jiàn)的是與靶蛋白賴氨酸的ε氨基團(tuán)相連。

EndoS糖苷內(nèi)切酶S在抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)上。通過(guò)上海藥物所的研究，開(kāi)發(fā)了一種新穎的糖鏈定點(diǎn)ADC制備策略，利用EndoS2這種糖苷內(nèi)切酶，可以將小分子細(xì)胞毒藥物“一步”定點(diǎn)連接到抗體的糖基化位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了糖鏈定點(diǎn)ADC化合物的制備。定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)相比傳統(tǒng)的隨機(jī)偶聯(lián)具有更好的方法指數(shù)，能夠提高ADC的均一性和穩(wěn)定性，是當(dāng)前ADC領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。在抗體的Fc結(jié)構(gòu)域N297位，這是一個(gè)保守的糖基化位點(diǎn)，通過(guò)在該位點(diǎn)引入細(xì)胞物質(zhì)，可以形成具有優(yōu)勢(shì)的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物（glycosite-specificADCs,gsADCs）。此外，EndoS2對(duì)多樣化的LacNAc修飾顯示出良好的兼容性，能夠高效獲得功能修飾的糖工程抗體，并且可以用于抗體的內(nèi)吞成像研究及糖鏈延伸等功能化研究。研究人員通過(guò)這種“一步”制備策略得到的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物，在結(jié)構(gòu)均一性、親水性、體外穩(wěn)定性以及體外活性方面表現(xiàn)良好，并且在體內(nèi)瘤抑制活性方面，相比陽(yáng)性對(duì)照ADC化合物，在低載藥量的情況下具有更強(qiáng)的抑制效果。EndoS酶的這些應(yīng)用，不僅展示了其在簡(jiǎn)化ADC制備流程中的潛力，還有助于推動(dòng)定點(diǎn)ADC藥物的深入發(fā)展，為未來(lái)的生物藥物開(kāi)發(fā)提供了新的思路和方法。泛素分子可以通過(guò)其內(nèi)部的賴氨酸殘基與其他泛素分子形成多聚泛素鏈，這一步驟通常由E3酶催化。HIV-1 TAT (48-60)

在基因編輯中，Pfu DNA Polymerase可以用于精確地引入特定位點(diǎn)的突變，或在基因組中插入特定的DNA序列。Recombinant Human Leptin Protein

PreScissionProtease（PSP）是一種由人鼻病毒14型的3C蛋白酶（humanrhinovirus(HRV)type143Cprotease）和GST組成的融合蛋白。它具有以下特點(diǎn)：1.**特異性識(shí)別**：PreScissionProtease能在低溫下（4°C）特異識(shí)別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切。2.**依賴結(jié)構(gòu)**：底物的識(shí)別和切割不僅依賴于融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，還依賴于融合蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。3.**分離GST標(biāo)簽**：它可以特異性的將pGEX-6P系列等載體表達(dá)出的帶有酶底物識(shí)別多肽序列融合蛋白的GST標(biāo)簽進(jìn)行分離。4.**表達(dá)宿主**：本品由大腸桿菌中重組表達(dá)，并以無(wú)菌液體形式提供。5.**物理性質(zhì)**：分子量約為46kDa，物理外觀為無(wú)菌無(wú)色液體。6.**儲(chǔ)存緩沖液**：25mMTris-HCl（pH8.0），150mMNaCl，1mMEDTA，5mMDTT，50%（V/V）Glycerin。7.**酶切緩沖液**：10×酶切緩沖液為500mMTris-HCl（pH7.0），1.5MNaCl，10mMEDTA，10mMDTT。8.**純度**：經(jīng)SDS-PAGE及HPLC分析，純度大于95%。9.**酶活定義**：在5℃條件下反應(yīng)16小時(shí)，能夠切割10μg的GST標(biāo)簽的融合蛋白達(dá)90%以上所需的酶量定義為一個(gè)活性單位。Recombinant Human Leptin Protein