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蛋白質(zhì)翻譯后修飾自中而下分析策略:自中而下的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可用于組蛋白修飾的分析。樣品制備與普遍使用的自下而上的分析策略相同,直到得到純化的組蛋白。提取組蛋白后,用GluC進(jìn)行消化。然后用弱陽離子交換/親水相互作用色譜(WCX-HILIC)與配備電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)的高分辨率質(zhì)譜聯(lián)機(jī)聯(lián)用,對樣品進(jìn)行理想的分離。譜識別可以用傳統(tǒng)的軟件進(jìn)行,但是由于估計適當(dāng)?shù)腻e誤發(fā)現(xiàn)率的問題,需要對結(jié)果進(jìn)行過濾。自上而下分析策略:自上而下的技術(shù)可以直接引入完整的蛋白質(zhì)并在串聯(lián)質(zhì)譜儀上對其進(jìn)行片段化,不需要蛋白質(zhì)水解消化。目前,有兩種完全分離蛋白質(zhì)的方法:離線和在線。前者用四維分離法,后者用WCX-HILIC。蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)具有全方面性。北京蛋白質(zhì)氧化修飾組學(xué)
蛋白翻譯后修飾位點鑒定:蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post-Translational Modifications, PTMs)幾乎參與了細(xì)胞所有正常生命活動的過程,并發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用。蛋白質(zhì)修飾位點能夠影響蛋白的多種屬性,包括蛋白質(zhì)折疊、活性以及之后的功能,對于蛋白質(zhì)修飾位點的發(fā)現(xiàn)及研究對闡明蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。技術(shù)特點:時間快,周期短;識別位點準(zhǔn)確,采用高分辨率質(zhì)譜技術(shù)可以準(zhǔn)確定位到發(fā)生修飾的氨基酸位點。適用范圍:已知蛋白序列;明確翻譯后修飾的類型。河南乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)分析在眾多乙酰化修飾的蛋白質(zhì)中,研究較多的要數(shù)細(xì)胞核中包圍DNA的組蛋白了。
磷酸化修飾蛋白組學(xué)應(yīng)用:蛋白質(zhì)組(Proteome)泛指一個生命體內(nèi)所有蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是以蛋白質(zhì)組為研究對象,研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué),是對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性、定量及功能的分析。定性分析包括鑒定蛋白質(zhì)的序列、PTM及蛋白之間的相互作用,對比來看,磷酸化蛋白質(zhì)組(Phosphoproteome)就是蛋白質(zhì)組中全部的磷酸化蛋白質(zhì),而磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)(Phosphoproteomics,下文簡稱PP)就是針對磷酸化蛋白質(zhì)的全方面的分析,包括對磷酸化的鑒定、定位和定量。本來屬于蛋白質(zhì)組學(xué)的一個分支,但隨著研究的深入,人們在各個領(lǐng)域關(guān)于PP都有重大發(fā)現(xiàn),基于PP的研究也越來越多。
蛋白質(zhì)糖基化修飾組學(xué)技術(shù)服務(wù):糖基化是在酶的控制下,蛋白質(zhì)或脂質(zhì)附加上糖類的過程,發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等部位。在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì),和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基共價結(jié)合。蛋白質(zhì)經(jīng)過糖基化作用,形成糖蛋白。糖基化是對蛋白的重要的修飾作用,有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能作用。凝素親和法是目前糖蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用比較普遍的分離富集方法。凝集素(lectin)是一類糖結(jié)合蛋白質(zhì),能專一識別某一特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中特定的糖基序列而與之結(jié)合,它們與糖鏈可逆非共價結(jié)合,糖蛋白或糖肽被凝集素捕獲之后,通常用特定的單糖通過競爭結(jié)合凝集素將糖蛋白或糖肽洗脫下來。泛素化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi),故名泛素。
磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué):在有機(jī)體內(nèi),磷酸化是蛋白翻譯后修飾中比較普遍的共價修飾形式,同時也是原核生物和真核生物中比較重要的調(diào)控修飾形式。磷酸化對蛋白質(zhì)功能的正常發(fā)揮起著重要的調(diào)節(jié)作用,該過程是由蛋白質(zhì)激酶(Kinase)催化的把ATP或GTP的γ位磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基,如絲氨酸(Serine,Ser,S)、蘇氨酸(Threonine,Thr,T)和酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y)等上的過程,而其逆向過程則是由蛋白質(zhì)磷酸酶去除相應(yīng)的磷酸基團(tuán)。正是這兩種酶的相反作用及其中所涉及到的能量消耗與生成使磷酸化成為體內(nèi)很多生理活動調(diào)控的首先選擇方式。蛋白質(zhì)乙?;彩且环N可逆的酶促反應(yīng)過程。湖北泛素化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究
蛋白質(zhì)翻譯后修飾PTMs通常包括磷酸化,糖基化,泛素化,亞硝基化,甲基化,乙?;?,脂質(zhì)化和蛋白水解。北京蛋白質(zhì)氧化修飾組學(xué)
蛋白質(zhì)翻譯后修飾在蛋白質(zhì)中磷酸化位點分析時應(yīng)該注意些什么問題?覆蓋率:覆蓋率越高,檢測和鑒定含有修飾基團(tuán)的肽幾率就越大。修飾位點的占有率:被修飾的蛋白質(zhì)的百分比低,則檢測到修飾肽的機(jī)會會隨之減少。如果百分比較高(> 30%),則有助于識別修飾位點。棕櫚?;鞍仔揎椯|(zhì)譜鑒定方法:S-棕櫚酰化的主要功能是促進(jìn)蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜的結(jié)合。蛋白質(zhì)可以由一個棕櫚酰基組成,也可以與更多棕櫚基或與其他脂質(zhì),如豆蔻?;?。由于對S-棕櫚?;鞍追治鋈匀痪哂刑魬?zhàn)性,由于S-棕櫚?;揎椀鞍讈喫揭约笆杷院蜐撛诓环€(wěn)定的硫代質(zhì)鏈的S-脂?;摹1本┑鞍踪|(zhì)氧化修飾組學(xué)