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《Cell Metab》解讀：分子互作基礎(chǔ)
分子互作基礎(chǔ)
課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，催化多不飽和脂肪酸(PUFAs)氧合的12-脂氧合酶(ALOX12)是高水平ROS誘導(dǎo)的鐵死亡應(yīng)答的關(guān)鍵因子。在本研究中，PHLDA2是否通過ALOX12的ROS調(diào)控系統(tǒng)誘導(dǎo)鐵死亡。
第一步，確定ROS鐵死亡系統(tǒng)的相互作用分子
通過SFB標(biāo)簽抗體，進(jìn)行IP-MS和IP-WB發(fā)現(xiàn)PHLDA2與ALOX12互作（圖1a、b）。進(jìn)一步通過內(nèi)源抗體Co-IP雙向驗證PHLDA2與ALOX12存在相互作用（圖1c-d）。而免疫熒光共定位實驗發(fā)現(xiàn)PHLDA2和ALOX12能夠同時共定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1e），進(jìn)一步佐證了PHLDA2-ALOX12復(fù)合體的存在。
第二步，確定PHLDA2和ALOX12互作特異性
PHLDA2屬于PH樣結(jié)構(gòu)域家族A，包括PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3（圖1f）。Co-IP實驗分析發(fā)現(xiàn)，PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3中，只有PHLDA2與ALOX12相互作用（圖1h-i）。
第三步，確定互作的結(jié)構(gòu)域（嚴(yán)謹(jǐn)）
為了確定PHLDA2與ALOX12互作的結(jié)構(gòu)域，對PHLDA2分別構(gòu)建PHLDA2全長、PHLDA2-PH、PHLDA2-ΔPH進(jìn)行GST pulldown和Co-IP實驗，發(fā)現(xiàn)ALOX12結(jié)合含有N端PH結(jié)構(gòu)域(aa7-101)，但不結(jié)合含有C端結(jié)構(gòu)域(ΔPH，aa102-152)（圖2a-c）。另外，對PHLDA2分別構(gòu)建PHLDA2全長、PHLDA2-BS、PHLDA2-ΔBS進(jìn)行Co-IP實驗分析，發(fā)現(xiàn)PHLDA2的高度保守的磷脂結(jié)合序列(BS，aa7-31)不是與ALOX12相互作用所必需的，但其旁邊的一個小區(qū)域(ΔBS，aa32-101)是ALOX12的主要對接位點（圖2a和2d）。
以上結(jié)果證實：PHLDA2與ALOX12直接相互作用。ALOX12是ROS鐵死亡的催化酶，這種互作是調(diào)控鐵死亡必須的嗎？需要進(jìn)一步探究！
全文分享：【《Cell Metab》解讀：鉚釘新型鐵死亡機制！PHLDA2通過招募脂氧合酶介導(dǎo)磷脂過氧化鐵死亡抑AI】。
如有相關(guān)機制研究，歡迎留言探討。
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