蘇州Vero細胞殘留DNA檢測原理

來源: 發(fā)布時間:2023-12-29

實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)在生物制品質(zhì)量控制方面應(yīng)用非常普遍,如宿主細胞殘留DNA檢測,鼠源、禽源等外源病毒檢測,微生物快檢(支原體、分枝桿菌、細菌、zhen等),復制型病毒檢測(RCL、RCR、rcAAV等)、質(zhì)??截悢?shù)檢測及其它工藝雜質(zhì)檢測等。qPCR檢測結(jié)果以擴增曲線圖呈現(xiàn),正常擴增曲線為S型,分為基線期、指數(shù)擴增期、線性擴增期和平臺期;線形光滑、拐點清晰,基線平直或略微下降,無明顯上揚。定量檢測實驗中,對標曲的要求主要從斜率(與擴增效率相關(guān))和R2兩方面進行考察,要求斜率滿足-3.8~-3.1(對應(yīng)擴增效率為83.3%~110%),R2滿足高于0.99。CHO宿主細胞殘留DNA檢測。蘇州Vero細胞殘留DNA檢測原理

南京正揚生物科技有限公司自主研發(fā)生產(chǎn)了一款E.coli宿主細胞殘留DNA檢測試劑盒,采用qPCR-熒光探針法,在qPCR技術(shù)的基礎(chǔ)上利用熒光探針原理,定量檢測樣本中E.coli殘留DNA,簡化qPCR反應(yīng)操作的反應(yīng)液配置時的操作步驟,檢測快速,專一性強,性能可靠,蕞檢測限可以達到fg水平。實驗操作步驟包括標準品稀釋、樣品前處理、樣品DNA提取純化、PCR試劑配制及加樣、PCR擴增檢測、實驗數(shù)據(jù)分析。


宿主細胞殘留DNA檢測過程中,標準品稀釋環(huán)節(jié)有哪些注意事項?①用來做稀釋的耗材建議使用1.5mL離心管,容量太大的耗材會增加DNA的吸附作用,容量太小易導致混勻不充分。②為了做出更好的線性,進行倍數(shù)稀釋的時候要吸取較大體積標準品溶液(避免用1μL標準品+9μL稀釋液這樣的小體積體系進行稀釋)。③每進行一步稀釋都要進行充分的混勻,在點樣前也要進行混勻。④為了提高準確性,每個濃度建議做3個復孔。 合肥殘留DNA檢測特點美國FDA對HEK293宿主細胞殘留DNA檢測的要求。

美國藥典(USP)對宿主細胞殘留DNA檢測的規(guī)定:美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)發(fā)布的指導原則中指出生物制品宿主細胞DNA殘余限度不得超過100pg/劑量,對于大劑量的如單克隆抗體的生物制品,根據(jù)其殘余DNA來源及給藥途徑,DNA殘留量可放寬至10ng/劑量?!睹绹幍洹?USP40-NF35)通則<1130>收錄了3種外源性DNA殘留量測定的方法,分別為DNA探針雜交法、閾值法和實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)法。

歐洲藥典(EP)對宿主細胞殘留DNA檢測的規(guī)定:歐洲藥品管理局指出需要對連續(xù)傳代哺乳細胞殘留DNA的去除過程進行工藝驗證,旨在確認去除殘留DNA的主要步驟,并確保此工藝程序可以將終產(chǎn)品中的殘留DNA控制在允許范圍[4]?!稓W洲藥典》(EP9.3)通則規(guī)定的生物制品殘留DNA限度大多為不超過10ng/劑量,但對個別疫苗的殘留DNA限定標準更嚴格,如甲型肝炎滅活疫苗中的殘留DNA不得超過100pg/劑量,乙型肝炎疫苗中的DNA殘留量不得超過10pg/劑量。

南京正揚生物科技有限公司自主研發(fā)生產(chǎn)的HEK293宿主細胞殘留DNA檢測試劑盒利用Taqman熒光探針原理,定量檢測各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成品中殘留的HEK293細胞DNA,產(chǎn)品具備檢測快速、操作簡單、特異性強、檢測靈敏度高、穩(wěn)定性好、能防止PCR產(chǎn)物污染等特點。蕞低檢測限可以達到fg級別。試劑盒配套有HEK293DNA定量參考品。產(chǎn)品檢測方法可溯源至中國藥典方法,通則〈3407〉。南京正揚生物科技有限公司自主研發(fā)生產(chǎn)的畢赤酵母宿主細胞殘留DNA檢測試劑盒利用Taqman熒光探針原理,定量檢測各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成品中殘留的畢赤酵母宿主DNA,檢測試劑盒具備檢測快速、操作簡單、檢測特異性強、檢測靈敏度高、穩(wěn)定性好、能防止PCR產(chǎn)物污染等特點。蕞檢測限可以達到fg級別。試劑盒配套有畢赤酵母DNA定量參考品。產(chǎn)品檢測方法可溯源至中國藥典方法,通則〈3407〉。qPCR法做宿主細胞殘留DNA檢測的優(yōu)缺點有哪些?

用qPCR法進行宿主細胞殘留DNA檢測時,出現(xiàn)擴增效率超出標準要求(低于83.3%或高于110%)的原因有哪些?①設(shè)計的引物探針不適用:重新分析靶標序列進行設(shè)計。②標曲濃度設(shè)定太高,超出標曲線性范圍:對范圍進行驗證,選取合適標曲范圍。③人員操作問題,如稀釋錯誤、制備過程震蕩時間過長等:人員上崗前應(yīng)接受多培訓并做到熟練操作,考核合格后方可上崗。④移液器未校準或品質(zhì)問題導致量取不準:定期對移液器進行校準并選擇好品質(zhì)移液器。宿主細胞殘留DNA檢測有哪些必要性?南京E.coli殘留DNA檢測

為什么要做宿主細胞殘留DNA檢測?蘇州Vero細胞殘留DNA檢測原理

為什么要做宿主細胞殘留DNA檢測?近年來熱度驟增的生物制品藥物對諸多疾病療效斐然,在藥品市場中所占比重也是節(jié)節(jié)攀升。于是生物制品與之俱來的生物安全性問題被漸漸提上日程,其中宿主細胞殘留DNA由于可能會傳遞仲或病毒相關(guān)基因,存在潛在的危險性,各國藥品監(jiān)督管理機構(gòu)對其殘留量有著嚴格的限度控制。同時,各國藥典也陸續(xù)提供數(shù)種關(guān)于宿主細胞殘留DNA檢測經(jīng)典的方法,目前以實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法為蕞優(yōu),因其專一性強、靈敏度高、快速且可實現(xiàn)高通量。蘇州Vero細胞殘留DNA檢測原理