南京正揚生物Vero細胞殘留DNA檢測方法學

來源: 發(fā)布時間:2023-12-27

各國藥品監(jiān)督管理機構對生物制品中宿主細胞殘留DNA檢測的要求:各國藥品監(jiān)督管理機構對生物制品中宿主細胞殘留DNA的態(tài)度謹慎且明確,要求各制藥企業(yè)建立詳細可行、靈敏度高的檢測方法,用于驗證藥品的純化過程可以去除殘留DNA,并對終產(chǎn)品的產(chǎn)品放行嚴格把關,避免攜帶外源DNA的藥品流入市場。與此同時,殘留DNA的檢測方法也在不斷升級和改進,研究者們旨在能夠更精確更快速地檢測含量較低的宿主DNA。我國對宿主細胞殘留DNA檢測的規(guī)定:鑒于外源性DNA對機體的潛在危害,自19世紀末,我國藥品相關機構,如衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管理局等頒布的一系列文件中都對殘余細胞DNA有明確的規(guī)定?!度擞弥亟MDNA制品質(zhì)量控制要點》中要求必須用敏感的方法測定來源于宿主細胞的殘余DNA含量,這對于用哺乳動物傳代細胞(轉(zhuǎn)化的細胞系)生產(chǎn)的制品尤為重要,一般認為殘余DNA含量小于100pg/劑是安全的,但應視制品的用途、用法和使用對象而決定可接受的限度。HEK293宿主細胞殘留DNA檢測的質(zhì)量控制。南京正揚生物Vero細胞殘留DNA檢測方法學

宿主細胞殘留DNA檢測:實時熒光定量PCR法宿主細胞殘留DNA檢測的原理和方法:實時熒光定量PCR是基于PCR擴增時,在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,產(chǎn)物的增加可以通過熒光信號指示,通過實時監(jiān)控PCR體系中的熒光信號,對樣本中初始模板進行定量分析。實時熒光定量PCR可實時檢測產(chǎn)物的生成量,通過加入已知濃度的標準樣品繪制標準曲線,然后根據(jù)待測樣品在標準曲線中的位置推算初始模板的濃度,從而達到檢測宿主細胞殘留DNA含量的目的。廣州SV40&E1A殘留DNA檢測服務CFDA對宿主細胞殘留DNA檢測的要求。

用qPCR法進行宿主細胞殘留DNA檢測時,出現(xiàn)擴增效率超出標準要求(低于83.3%或高于110%)的原因有哪些?①設計的引物探針不適用:重新分析靶標序列進行設計。②標曲濃度設定太高,超出標曲線性范圍:對范圍進行驗證,選取合適標曲范圍。③人員操作問題,如稀釋錯誤、制備過程震蕩時間過長等:人員上崗前應接受培訓并做到熟練操作,考核合格后方可上崗。④移液器未校準或品質(zhì)問題導致量取不準:定期對移液器進行校準并選擇好品質(zhì)移液器。

用qPCR法進行宿主細胞殘留DNA檢測時,出現(xiàn)擴增曲線異常的可能原因是什么?①軟件參數(shù)設置不當可能引起標曲參數(shù)或檢測結(jié)果異常。如擴增曲線信號早出現(xiàn)在14個循環(huán)左右,基線卻設置為3-15,導致儀器將14個循環(huán)出現(xiàn)的熒光信號默認為基線部分,出現(xiàn)結(jié)果異常。建議將BaselineEnd設置為擴增信號出現(xiàn)的前一個循環(huán),或由軟件自動設置。②擴增曲線飄起:該現(xiàn)象通常出現(xiàn)于高濃度模板情況下,擴增曲線Ct值在10以內(nèi)的樣品。針對此類樣品檢測,設置標曲時建議盡量控制標曲蕞濃度Ct值控制在10以上。檢測樣品時建議對樣品進行稀釋后再測試。

凍干人用狂犬病疫苗以其在生產(chǎn)工藝、經(jīng)濟效益和質(zhì)量等方面的綜合優(yōu)勢,占據(jù)了我國的大部分狂犬病疫苗市場。目前,人用狂犬病疫苗的生產(chǎn)需要經(jīng)過Vero細胞培養(yǎng)、病毒增殖、病毒收獲和濃縮、病毒滅活以及純化等過程。然而,在細胞培養(yǎng)和病毒增殖的過程中,會產(chǎn)生游離的宿主DNA及與病毒蛋白結(jié)合的宿主DNA。這些殘留DNA會隨疫苗一起被注入到人體內(nèi),使得人體由于異源物質(zhì)的注入引起不良反應。鑒于上述風險,國內(nèi)外監(jiān)管部門分別出臺了相應的指導原則并提供了宿主細胞殘留DNA檢測的方法。HEK293宿主細胞殘留DNA檢測試劑盒。

為什么要做宿主細胞殘留DNA檢測?眾所周知,大部分生物制劑是不經(jīng)過胃腸道直接進入體內(nèi),所以除了生物活性外,相關部門對藥品中雜質(zhì)的含量要求非常嚴格。其中,宿主細胞殘留DNA因為具有特別的潛在安全風險,一直是監(jiān)管機構關注的重點。生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的動物細胞株表達生產(chǎn),雖然經(jīng)過嚴格的純化工藝,但產(chǎn)品中仍有可能殘余宿主細胞DNA。這些殘余DNA可能帶來傳染性或致瘤性風險,比如殘留DNA可能攜帶HIV病毒或Ras  ai基因。美國FDA對宿主細胞殘留DNA檢測的要求。杭州正揚生物HEK293T殘留DNA檢測優(yōu)缺點

畢赤酵母宿主細胞殘留DNA檢測的質(zhì)量控制。南京正揚生物Vero細胞殘留DNA檢測方法學

各國藥典對于宿主細胞殘留DNA檢測方法的推薦:理想的定量檢測方法其靈敏度應能檢測到約10pg/劑量的殘留DNA。雜交法、基于DNA結(jié)合蛋白的免疫色譜法(閾值法)和定量PCR方法因靈敏度均可達到檢測要求,都屬于經(jīng)典方法。①《美國藥典》將高靈敏度、高特異性的qPCR法和非序列特異性的DNA結(jié)合蛋白法作為殘留DNA檢測的推薦方法;③《歐洲藥典》將高靈敏度、高特異性的qPCR法和非序列特異性的DNA結(jié)合蛋白法作為殘留DNA檢測的推薦方法;②《中國藥典》則收錄了特異性高的定量PCR法和半定量的DNA探針雜交法以及非序列特異性的熒光染色法。南京正揚生物Vero細胞殘留DNA檢測方法學