莖環(huán)法逆轉錄是一種逆轉錄反應的技術，它利用莖環(huán)結構的RNA分子作為反向引物，在逆轉錄過程中特異性地擴增目標RNA分子。該技術在分子生物學和醫(yī)學研究中得到了普遍的應用，特別是在RNA的研究和檢測中具有獨特的優(yōu)勢。莖環(huán)法逆轉錄技術的基本原理是利用逆轉錄酶和莖環(huán)結構的RNA作為反向引物，將RNA逆轉錄成cDNA，并在PCR反應中擴增。莖環(huán)結構的RNA分子具有較高的穩(wěn)定性和特異性，可以特異性地識別和結合目標RNA分子，從而在逆轉錄反應中作為反向引物擴增目標cDNA。此外，由于莖環(huán)結構的RNA分子與目標RNA分子的堿基序列互補，因此莖環(huán)法逆轉錄技術可以避免隨機引物引起的非特異擴增。逆轉錄活性可以RNA為模板，合成與其序列互補的DNA鏈，生成DNA-RNA雜合雙鏈。北京一體化逆轉錄酶純度高
逆轉錄酶實驗一步法與兩步法具有以下區(qū)別：一步法比兩步法更快速、簡便、減少了污染機會、減少了RNA二級結構、減少了PCR反應的錯配率；兩步法的優(yōu)勢在于中間產物cDNA，便于保存；且第二步PCR只取逆轉錄反應產物的1/10進行反應，有利于PCR條件的調整，實驗重現性強；兩步法可以在第二步PCR反應體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法包括首先鏈cDNA合成和隨后的PCR反應，容易產生污染問題；兩步法的實驗預算要低于一步法。北京一體化逆轉錄酶純度高逆轉錄實驗盡量避免多次凍融處理RNA樣品，避免樣品質量下降。
反轉錄酶的注意事項，隨機引物：適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，首先鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（<500bp）的增加和長片斷、全長產物產物的降低。酵母菌逆轉錄酶是逆轉錄酶家族中的一個重要表示，逆轉錄在研究RNA表達調控等領域有普遍的應用前景。
反轉錄酶的注意事項，在進行RT反應之前，應考慮以下幾個方面：RNA：成功的cDNA合成來自高質量的RNA，高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。在提取RNA的過程中，要特別防止RNase的污染，同時在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在首先鏈cDNA合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑只防止RNaseA，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實驗過程中經常更換新手套。逆轉錄實驗要使用高質量的反轉錄酶和逆轉錄引物，避免引物交叉污染。
miRNA的加尾法逆轉錄和qPCR，miRNA與mRNA不同，成熟的miRNA的長度只有20nt左右，非常短，通常正向引物就足以覆蓋其全長甚至有余，反向引物就無處安放了。那么如何實現miRNA的qPCR擴增呢？解決方案就是在逆轉錄的時候設法增加逆轉錄產物長度。普遍的方法有兩種，加尾法和莖環(huán)法。經過加尾法或莖環(huán)法這種特殊的逆轉錄形式處理之后，得到的cDNA長度從原始的20nt增加到80nt以上，這樣就能夠實現miRNA的qPCR擴增了。RNA逆轉錄實驗注意事項：選擇合適的引物：但其對RNA的完整度和二級結構的要求較高，而且不適用于原核生物。隨機引物可以根據堿基情況結合到幾乎所有的RNA上，包括mRNA、tRNA和rRNA。逆轉錄酶通常具有多種活性，如逆轉錄活性、復制活性與RNA酶H活性。廣州莖環(huán)法反轉錄制造商
逆轉錄實驗過程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉錄酶的選擇。北京一體化逆轉錄酶純度高
逆轉錄實驗步驟：引物濃度計算方法：（新合成的引物的稀釋）假如終濃度為XuM（pmol/ul）加DEPC水體積（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）。用AMV逆轉錄酶進行RT（10ul體積）1、準備0.65mlEP管。2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA。3、稍離心，100℃沸水裕1min。4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆轉錄酶。5、稍離心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT。6、100℃沸水裕3min滅活AMV。7、立即PCR或－20℃保存。逆轉錄實驗時注意事項：為避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。北京一體化逆轉錄酶純度高