磁珠法提取DNA提取方法的工作原理:磁珠法是通過裂解液裂解細(xì)胞組織樣本,從樣本中游離出來的核酸分子被特異的吸附到磁性顆粒表面,蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不被吸附而留在溶液中。將攜帶核酸的磁珠移動(dòng)至不同的試劑槽內(nèi),通過反復(fù)快速攪拌、混勻液體,經(jīng)過細(xì)胞裂解、核酸吸附、洗滌與洗脫等步驟,較終得到純凈的核酸。磁珠提取DNA原理:電荷的鹽離子的作用(如Na+),帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)借由解離的鹽離子(如Na+)與羧基形成離子橋,使DNA被特異性吸附到羧基磁珠表面。當(dāng)PEG與鹽類被去除之后,加入水性分子,會(huì)快速充分水化DNA,解除其三者之間的離子相互作用,使得吸附到磁珠的DNA被純化出來。DNA提取需要細(xì)胞裂解與細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞膜。無錫RNA提取生產(chǎn)廠家
血漿DNA與血漿游離DNA提取試劑有較高的提取得率。DNA核酸提取得率的確定,常用的是使用紫外分光光度計(jì)的方法。但是,血清、血漿dna樣本中游離核酸含量較低,如果直接用紫外法檢測(cè),得出的數(shù)值并不準(zhǔn)確,而且多次測(cè)量的結(jié)果會(huì)變異很大。關(guān)于提取得率,Qiagen的研究數(shù)據(jù)是1ml正常血漿樣本cfDNA得為7.35ng左右,但如果白細(xì)胞大量凋亡,血漿中的游離DNA量會(huì)有所增加,腫病人的血漿DNA會(huì)大幅增加。有些研究者提取血漿DNA后習(xí)慣于先用紫外檢測(cè)濃度,發(fā)現(xiàn)紫外檢測(cè)不出來或濃度很低時(shí)便認(rèn)為提取失敗,放棄后面進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn),其實(shí)并不可取。我們可以把紫外讀數(shù)作為參考,但是不能作為判斷得率的只一標(biāo)準(zhǔn),較好還是要做個(gè)PCR或熒光定量。無錫RNA提取生產(chǎn)廠家DNA提取需要通過添加RNase消化RNA。
DNA提取定量:分光光度法:測(cè)定DNA在A260的光吸收,計(jì)算濃度。雙鏈DNA:A260*稀釋倍數(shù)*50(ug/ml)單鏈DNA:A260*稀釋倍數(shù)*40(ug/ml)單鏈核苷酸DNA:A260*稀釋倍數(shù)*20(ug/ml).瓊脂糖平板法:在含溴乙錠的瓊脂糖平板上滴1-5ul樣品DNA和已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品,放置數(shù)小時(shí)后檢測(cè)。微型凝膠電泳:將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)電泳,染色,比較熒光強(qiáng)度。DNA提取之貯存:短期儲(chǔ)存:4℃或-20℃存放于TE緩沖液中。長(zhǎng)期貯存:在70%乙醇,或在DNA溶液中加一滴氯仿,-70℃保存。
RNA提?。?.凍存細(xì)胞與新鮮細(xì)胞的RNA提取有區(qū)別嗎?具體該怎么操作?新鮮細(xì)胞與凍存細(xì)胞RNA提取沒什么區(qū)別。千萬不能等細(xì)胞溶解了存狀態(tài)把Trizol直接加到凍存管了,一起化開,振蕩振蕩就可以了。與從組織中提RNA差不多。2.RNA得率低:該組織或者細(xì)胞中RNA含量偏低:不同細(xì)胞和組織中RNA的豐度不同,如肝臟,胰腺,心臟等是高豐度組織(總RNA含量2-4μg/mg),腦,胚胎,腎臟,肺,胸腺,卵巢等是中豐度組織(總RNA含量0.05-2μg/mg),膀胱,骨,脂肪等是低豐度組織(總RNA含量<0.05μg/mg)。組織起始量太少或者太多:樣品量過少,則細(xì)胞組織中RNA含量較低;樣品量過多則可能超過裂解液的裂解能力,裂解將不完全,從而導(dǎo)致RNA得率低。DNA提取的樣品準(zhǔn)備之生物組織:較好新鮮組織,若不能馬上提取,應(yīng)貯存-70℃或液氮。
DNA提取的幾種方法介紹,以稀鹽酸溶液提取DNA時(shí),加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離.在提取過程中為抑制組織中的DNase對(duì)DNA的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA。陰離子去污劑法:用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA.由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA。DNA提取的過程中需要注意消毒和安全措施,以避免污染和傷害。常州組織DNA提取
DNA提取的不同方法可以用于不同類型的樣品和研究目的。無錫RNA提取生產(chǎn)廠家
DNA提取的原則:1.保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性;2.核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子;3.其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到較低程度;4.其他核酸分子,如RNA,也應(yīng)盡量去除。DNA提取的樣品準(zhǔn)備:生物組織:一.較好新鮮組織,若不能馬上提取,應(yīng)貯存-70℃或液氮。二.液氮冷凍敲碎研磨。三.組織勻漿法。四.液氮?jiǎng)驖{法。培養(yǎng)細(xì)胞:懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞:1500g離心,4℃10分種收集細(xì)胞。單層培養(yǎng)細(xì)胞:可用刮棒或胰酶消化后離心收集。血液樣品:血液樣品一.血液抗凝易用檸檬酸抗凝液(ACD):檸檬酸0.48g;檸檬酸鈉1.32g;右旋葡萄糖1.47g加H2O至100ml,每6ml新鮮血液加1mlACD液零度保存數(shù)天,-70度長(zhǎng)期貯存。無錫RNA提取生產(chǎn)廠家
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