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pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶是一種經(jīng)過特殊改造的融合蛋白,由ProteinA和高活性的Tn5轉(zhuǎn)座酶組成,具有以下主要應(yīng)用:1.**高通量測序建庫**:pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶可以用于快速構(gòu)建用于高通量測序的DNA文庫,通過其轉(zhuǎn)座酶活性實(shí)現(xiàn)DNA片段化,同時(shí)加上測序接頭,簡化了傳統(tǒng)DNA測序建庫的多步過程。2.**CUT&Tag技術(shù)**:這是一種新興的蛋白質(zhì)與DNA相互作用研究方法,pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶利用ProteinA與特定抗體結(jié)合,將轉(zhuǎn)座酶帶到目標(biāo)蛋白附近進(jìn)行DNA切割和標(biāo)簽添加,實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的高通量測序分析。CUT&Tag技術(shù)具有高特異性、低背景噪音、高靈敏度、良好重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn),適用于表觀遺傳學(xué)、干細(xì)胞等領(lǐng)域的研究。3.**ATAC-seq**:pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶也可用于ATAC-seq實(shí)驗(yàn),這是一種研究染色質(zhì)可及性的方法,通過轉(zhuǎn)座酶在沒有核酸酶消化的情況下切割染色質(zhì)DNA,然后在切割位點(diǎn)加上測序接頭,進(jìn)行后續(xù)的測序分析。4.**轉(zhuǎn)錄組測序快速建庫**:有研究開發(fā)了基于Tn5轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄組測序快速建庫方法,例如SHERRY方法,它利用Tn5轉(zhuǎn)座酶直接作用于RNA/DNA雜交鏈,簡化了建庫過程,適用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序,提高了樣本的利用率和測序速度。
轉(zhuǎn)座酶是一類能夠催化轉(zhuǎn)座子(一種可移動(dòng)的DNA序列)在基因組中從一個(gè)位置移動(dòng)到另一個(gè)位置的酶。轉(zhuǎn)座子可以在DNA分子上“跳躍”,在新的位置上插入自己的拷貝,而原始位置的轉(zhuǎn)座子則可能被切除或保留。轉(zhuǎn)座酶的作用是轉(zhuǎn)座過程中的關(guān)鍵因素,它們可以被分為兩類:1.**復(fù)制型轉(zhuǎn)座酶**:在復(fù)制型轉(zhuǎn)座過程中,轉(zhuǎn)座子首先被復(fù)制,然后復(fù)制的拷貝到新的基因組位置,原始的轉(zhuǎn)座子留在原位。這種機(jī)制通常涉及到“復(fù)制-粘貼”的過程。2.**剪切型轉(zhuǎn)座酶**:在剪切型轉(zhuǎn)座過程中,轉(zhuǎn)座子從原始位置被切除,然后到新的基因組位置。這涉及到“剪切-粘貼”的過程。轉(zhuǎn)座酶的活性和轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)可以對(duì)基因組的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響,包括:-**基因突變**:轉(zhuǎn)座子的插入可能破壞基因的正常功能,導(dǎo)致突變。-**基因組多樣性**:轉(zhuǎn)座活動(dòng)增加了基因組的多樣性,有助于物種適應(yīng)環(huán)境變化。-**基因調(diào)控**:轉(zhuǎn)座子的插入可能激起或抑制某些基因的表達(dá)。-**新基因產(chǎn)生**:在某些情況下,轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)可以導(dǎo)致新基因的產(chǎn)生。
1stStrandcDNASynthesisKit(RNaseH-)是一種用于合成互補(bǔ)DNA(cDNA)的試劑盒,它通過逆轉(zhuǎn)錄過程從信使RNA(mRNA)或總RNA模板合成cDNA的鏈。這類試劑盒通常包含逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase,RT)和其他必要的組分,以確保高效和準(zhǔn)確的cDNA合成。RNaseH-表示該試劑盒使用的逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏RNaseH活性,這意味著在合成cDNA鏈的過程中不會(huì)發(fā)生RNA的降解,從而可以產(chǎn)生更高產(chǎn)量的全長cDNA,特別是從較長的模板(可達(dá)13kb)。該試劑盒通常包括以下組分:-逆轉(zhuǎn)錄酶,如RevertAidHMinusM-MuLVReverseTranscriptase,它通過點(diǎn)突變完全消除了RNaseH活性。-RiboLockRNaseInhibitor,這是一種重組蛋白,可有效保護(hù)RNA在高達(dá)55°C的溫度下不受RNases的降解。-緩沖液、dNTPs(去氧核苷酸三磷酸)和其他輔助成分,以支持cDNA合成反應(yīng)。-有時(shí)還包括用于去除RNA樣品中污染的基因組DNA的DNaseI。合成的cDNA可以作為PCR或?qū)崟r(shí)PCR的模板直接使用,也適用于第二鏈cDNA合成或線性RNA放大。此外,可以在cDNA合成過程中加入放射性或非放射性標(biāo)記的核苷酸,以便在包括微陣列在內(nèi)的雜交實(shí)驗(yàn)中作為探針使用。
pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶的高活性是其重要特性之一,這種高活性主要來源于以下幾個(gè)方面:1.**轉(zhuǎn)座酶突變體**:pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶是由Tn5轉(zhuǎn)座酶的高活性突變體構(gòu)成的。這種突變體相比野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶,在體外的轉(zhuǎn)座效率顯著提高,通常提升1000倍以上。2.**ProteinA融合**:pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶將ProteinA與高活性Tn5轉(zhuǎn)座酶融合,這種融合不僅保留了Tn5轉(zhuǎn)座酶的高效DNA切割能力,還通過ProteinA的抗體結(jié)合特性,提高了對(duì)特定DNA序列的靶向能力。3.**轉(zhuǎn)座隨機(jī)性**:pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶能夠在整個(gè)基因組上實(shí)現(xiàn)隨機(jī)的DNA切割,這為高通量測序提供了廣的覆蓋度。4.**穩(wěn)定性**:高活性的pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶在各種實(shí)驗(yàn)條件下都能保持穩(wěn)定,包括在不同的溫度和pH值條件下。5.**插入位點(diǎn)易測序**:pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶產(chǎn)生的DNA片段具有明確的插入位點(diǎn),這些位點(diǎn)容易被高通量測序技術(shù)識(shí)別和分析。6.**高效片段化**:在CUT&Tag等實(shí)驗(yàn)中,pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶能夠高效地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白結(jié)合DNA的片段化,為后續(xù)的測序和分析打下基礎(chǔ)。7.**低細(xì)胞投入量**:由于其高活性,pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶允許從極少量的細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),如單細(xì)胞水平的研究。
RNaseH-(RNaseH缺乏)通常是指在某些逆轉(zhuǎn)錄酶中通過突變消除了RNaseH活性的酶。這種酶在合成cDNA鏈時(shí)不會(huì)降解RNA模板,因此可以用于生成更高產(chǎn)量的全長cDNA,尤其是在使用較長的RNA模板時(shí)。RNaseH-的應(yīng)用主要包括:1.**全長cDNA合成**:由于RNaseH-不會(huì)在逆轉(zhuǎn)錄過程中降解RNA模板,因此可以合成更長的cDNA片段。2.**提高cDNA產(chǎn)量**:在某些情況下,使用RNaseH-可以提高cDNA的產(chǎn)量,特別是當(dāng)RNA模板質(zhì)量較高時(shí)。3.**避免RNA降解**:在逆轉(zhuǎn)錄過程中,RNaseH-有助于保護(hù)RNA模板不被降解,這對(duì)于后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)非常重要。4.**特定基因表達(dá)分析**:RNaseH-可用于合成特定基因的cDNA,進(jìn)而進(jìn)行基因表達(dá)分析。5.**RNA病毒研究**:在研究RNA病毒時(shí),RNaseH-可用于合成病毒RNA的cDNA,以便進(jìn)一步研究病毒的基因組。6.**基因克隆和功能研究**:合成的全長cDNA可以用于克隆和研究基因的功能。7.**提高qPCR和RT-qPCR的效率**:使用RNaseH-合成的cDNA作為模板,可以提高定量PCR的效率和準(zhǔn)確性。8.**RNA干擾和基因沉默研究**:RNaseH-有助于合成siRNA或shRNA,進(jìn)而研究基因沉默的效果。
GPCR家族是一類存在于生物體中的跨膜蛋白,它們可以識(shí)別并與外界分子相互作用,引發(fā)各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。Recombinant Human PSMA/FOLH1 Protein,hFc Tag
1stStrandcDNASynthesisKit(RNaseH-)中的逆轉(zhuǎn)錄酶(ReverseTranscriptase,RT)具有一個(gè)關(guān)鍵特性:它們通過特定的突變消除了RNaseH活性。RNaseH是一種通常與某些逆轉(zhuǎn)錄酶相關(guān)的酶活性,它能夠降解RNA。然而,在1stStrandcDNASynthesisKit(RNaseH-)中,逆轉(zhuǎn)錄酶被設(shè)計(jì)成不具有這種降解RNA的能力,從而在合成cDNA的鏈時(shí)保護(hù)RNA模板不被降解。以下是1stStrandcDNASynthesisKit(RNaseH-)中逆轉(zhuǎn)錄過程的一般步驟,以及如何避免RNA降解:1.**RNA模板準(zhǔn)備**:首先確保RNA模板的純度和完整性,避免DNA污染??梢酝ㄟ^DNaseI處理去除RNA樣品中的DNA污染。2.**混合反應(yīng)組分**:將RNA模板、dNTPs(去氧核苷酸三磷酸)、逆轉(zhuǎn)錄引物(如oligo(dT)或隨機(jī)引物)和緩沖液混合。3.**逆轉(zhuǎn)錄酶添加**:加入經(jīng)過突變處理的逆轉(zhuǎn)錄酶,這種酶缺乏RNaseH活性,因此不會(huì)在合成過程中降解RNA。4.**逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**:在適宜的溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),逆轉(zhuǎn)錄酶根據(jù)RNA模板合成cDNA鏈。5.**終止反應(yīng)**:通過加熱至一定溫度來終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Recombinant Human PSMA/FOLH1 Protein,hFc Tag