隨著技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,結(jié)合它的特點(diǎn),大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,大致可從兩個方面入手,裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,我們可以把激光束變得更細(xì),使能量更加集中,就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,解決這個問題,我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,讓標(biāo)本“透明度”提高。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn);國外2PPLUS雙光子顯微鏡作用
在國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制專項(xiàng)《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下,北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動態(tài)成像中心、生命科學(xué)學(xué)院、工學(xué)院聯(lián)合中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團(tuán)隊(duì),歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn),成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊NatureMethods(IF25.3),并已申請多項(xiàng)。2PPLUS雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光,是通過物鏡匯聚的。
2020年12月22日,臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺潘琳老師主持。王愛民,北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,獲學(xué)士、碩士學(xué)位,后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”,并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前,該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,為未來即時病理、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。
后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用碘化丙啶(PI)來指示細(xì)胞在7、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況,來驗(yàn)證該光學(xué)系統(tǒng)對活細(xì)胞長期觀察的適用性。在觀察期間,88個焦點(diǎn)以100毫秒的曝光時間,曝光間隔1s照射樣品,激發(fā)強(qiáng)度為3.21×104W/cm2,激發(fā)波長為525nm,使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑,圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖,(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s,得到相應(yīng)的(i)-(p)。由圖像可知,延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細(xì)胞損傷,對于實(shí)際3D延時成像,由于焦平面是移動的,所以預(yù)期細(xì)胞存活時間會更長,可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案。雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢?
雙光子顯微鏡的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,為了不損傷細(xì)胞,雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖寬度只有100飛秒,而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,提高了熒光檢測效率。雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。國外2PPLUS雙光子顯微鏡作用
雙光子顯微鏡在多個領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例。國外2PPLUS雙光子顯微鏡作用
雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出,30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,這要求極高的電場強(qiáng)度,而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,脈寬越窄,雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?;谝陨戏治?,能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢:只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,而近紅外相比可見光穿透更深,對生物樣品損傷更小。國外2PPLUS雙光子顯微鏡作用