qPCR的熒光標(biāo)記方法分為以SYBR Green I染料法為主的熒光染料嵌合法，以Taqman探針?lè)橹鞯臒晒馓结樂(lè)ǎ–ycling Probe，Molecular Bracon等），淬滅染料引物法。SYBR Green I 是高靈敏度的非特異性雙鏈DNA熒光染料，具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)。它以非特異性方式結(jié)合在dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域。游離的SYBR Green I 只發(fā)出極弱的熒光信號(hào)，PCR過(guò)程中，當(dāng)擴(kuò)增生成dsDNA時(shí)，SYBR Green I 逐漸與dsDNA結(jié)合，熒光信號(hào)被千倍放大，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比。熒光信號(hào)被儀器檢測(cè)并采集得到“擴(kuò)增曲線”，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)度反映出體系中dsDNA的濃度。為了增加qPCR實(shí)驗(yàn)可靠性、重復(fù)性，需要制定統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行規(guī)范。上?？焖賟PCR儀消毒
原理：在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，通過(guò)熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)定每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量。目的：實(shí)現(xiàn)定量而不止是定性分析。通過(guò)與內(nèi)參基因進(jìn)行對(duì)比，對(duì)樣品中的特定基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，以實(shí)現(xiàn)定量分析。qPCR的檢測(cè)方法有兩種，SYBRGreenl法和TaqMan探針?lè)?，下面介紹常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，使其特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。試劑及儀器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix試劑(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。上?？焖賟PCR儀消毒qPCR只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量，即必須使用標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，才能進(jìn)行定量。
PCR：Polymerase chain reaction. 是體外模擬生物的DNA 復(fù)制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，兩端引物，脫氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及適當(dāng)?shù)木彌_體系。PCR 產(chǎn)物的增長(zhǎng)形式為２N (如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N 是循環(huán)數(shù))。實(shí)際中，擴(kuò)增效率不為100％。Real time PCR 是定量PCR 的一種，當(dāng)然是在PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的。（普通）PCR 包含很多因素，屬性，如：試劑，溫度，循環(huán)數(shù)，程序，PCR 產(chǎn)物（擴(kuò)增子，amplicon）的量，擴(kuò)增曲線（擴(kuò)增子累積曲線），摻錯(cuò)率，擴(kuò)增子長(zhǎng)度。一般來(lái)說(shuō)，人們關(guān)心的是擴(kuò)增子的量。而real time PCR 主要利用的是擴(kuò)增曲線（amplification curve）, 循環(huán)數(shù)；擴(kuò)增子長(zhǎng)度，擴(kuò)增效率，擴(kuò)增子多少，也加以考慮。
Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)主要特點(diǎn)：精確定量 以可靠的數(shù)據(jù)助力您的研究。采用擬合算法計(jì)算 Ct 值，定量誤差不超過(guò)±10%。液體冷卻循環(huán)系統(tǒng)確?？组g溫度高度一致，溫差不超過(guò) ±0.15°C。光學(xué)系統(tǒng)無(wú)運(yùn)動(dòng)部件，穩(wěn)定性增加，長(zhǎng)期使用無(wú)需校準(zhǔn)與維護(hù)。的儀器間重復(fù)性，不同位置、不同反應(yīng)體積均不影響定量結(jié)果。快速高效 用更短的時(shí)間獲得更多數(shù)據(jù)。40 個(gè)循環(huán)的常規(guī) qPCR 只需43 分鐘，較常見(jiàn)qPCR 儀多縮短60% 的時(shí)間。在提高速度的同時(shí)保持了96 孔的高通量，滿(mǎn)足絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)需求。小巧輕便 節(jié)省空間及您的寶貴樣品小體積為移動(dòng)實(shí)驗(yàn)和大量部署提供可能。5-10 μl 的推薦反應(yīng)體積，較常規(guī)實(shí)驗(yàn)節(jié)省80%的試劑用量，更節(jié)約您的珍貴樣品。自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)被發(fā)明以來(lái)，其簡(jiǎn)單、可靠、快速、靈敏的質(zhì)量，PCR是分子生物學(xué)中使用的技術(shù)。
制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來(lái)完成。注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過(guò)解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲(chǔ)存。定量DNA——測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)-DNA水平在該步驟中，通過(guò)qPCR定量純化的DNA產(chǎn)物，通過(guò)qPCR，您可以確定目標(biāo)蛋白是否存在于特定位點(diǎn)。ChIP的qPCR如何定量分析ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)需要針對(duì)可變性來(lái)源進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，包括染色質(zhì)數(shù)量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。兩種常用的標(biāo)準(zhǔn)化 ChIP-qPCR 數(shù)據(jù)方法——Percent Input法和富集倍數(shù)法（Fold Enrichmen）。與input相關(guān)的ChIP-qPCR數(shù)據(jù)包括ChIP的背景水平和input染色質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化。建議ChIP 實(shí)驗(yàn)重復(fù)，盡可能將結(jié)果與背景信號(hào)和標(biāo)準(zhǔn)誤差一起顯示。由于qPCR的高靈敏性，陰性對(duì)照有出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)的情況，那么在針對(duì)這類(lèi)問(wèn)題時(shí)，我們需要判斷其原因所在。佛山快速qPCR儀型號(hào)
定量檢測(cè)是一種實(shí)時(shí)的PCR (qPCR) 檢測(cè)。測(cè)量（定量）每輪PCR擴(kuò)增循環(huán)中，檢測(cè)目標(biāo)核酸片段的量。上?？焖賟PCR儀消毒
相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)方法包括兩種重要方法：ΔΔCT Method：使用內(nèi)參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因。內(nèi)參基因與目的基因可以同時(shí)反應(yīng)，也可以單獨(dú)反應(yīng)；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法：對(duì)每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做定量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的數(shù)量，然后根據(jù)相對(duì)定量的基本公式來(lái)求出目的基因的差異表達(dá)。定量需要由標(biāo)準(zhǔn)曲線建立Ct值跟拷貝數(shù)之間的關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)品生成，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知濃度的RNA、質(zhì)?；蚝铣傻墓押塑账徭溕?，定量未知模板時(shí)標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品必須同時(shí)反應(yīng)。上海快速qPCR儀消毒
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