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蛋白質(zhì)翻譯后修飾分析策略:早期蛋白質(zhì)組研究的大部分工作集中在細(xì)胞生長的不同時(shí)期,或疾病或有絲分裂原刺激后的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。然而,許多生命過程不只受蛋白質(zhì)的相對豐度控制,還受時(shí)空分布可逆的翻譯后修飾控制。因此,揭示翻譯后修飾的規(guī)律是了解蛋白質(zhì)復(fù)雜性和多樣的生物學(xué)功能的前提。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是一個(gè)復(fù)雜的過程。目前,發(fā)現(xiàn)的比較常見的修飾類型是糖基化、泛素化和磷酸化。樣品中翻譯后修飾蛋白質(zhì)含量低、動(dòng)態(tài)范圍廣給相關(guān)研究帶來了很大的挑戰(zhàn)。基于翻譯后修飾蛋白的異質(zhì)性和相對豐度低的特點(diǎn),主要利用凝膠、生物質(zhì)譜和生物信息學(xué)工具對其進(jìn)行研究。用于PTM分析的質(zhì)譜方法類似于用于“常規(guī)”蛋白質(zhì)鑒定的方法,包括自下而上、自中而下和自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。蛋白磷酸化修飾過程是通過蛋白激酶催化,將磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到多肽底物的絲氨酸、或酪氨酸殘基上。濟(jì)南磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)
蛋白質(zhì)學(xué)組翻譯后修飾的類型:翻譯后修飾的類型包括N端fMet或Met的去除、二硫鍵的形成、化學(xué)修飾和肽鍵的裂解,其中磷酸化是比較常見的。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾反應(yīng)是在維持蛋白質(zhì)的完整性和功能性的基礎(chǔ)上,通過基于其氨基酸殘基的化學(xué)反應(yīng)獲得新的生物結(jié)合物。翻譯后修飾在哪里發(fā)生?翻譯后修飾主要發(fā)生在氨基酸側(cè)鏈或蛋白質(zhì)的C端或N端。現(xiàn)有的官能團(tuán)或新官能團(tuán)的引入可被用于修飾蛋白質(zhì),以擴(kuò)展20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的化學(xué)組成。翻譯后修飾的位點(diǎn)通常帶有可以在化學(xué)反應(yīng)中充當(dāng)親核試劑的官能團(tuán),如絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的羥基;賴氨酸、精氨酸和組氨酸胺形式;同時(shí),在蛋白質(zhì)的N端和C端,天冬酰胺也可作為翻譯后修飾中的一種聚糖連接點(diǎn)。翻譯后修飾也發(fā)生在氧化的蛋氨酸和側(cè)鏈位點(diǎn)的一些亞甲基上。貴州蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學(xué)服務(wù)蛋白質(zhì)翻譯后修飾有什么生物學(xué)意義?
質(zhì)譜分析蛋白翻譯后修飾原理:相較于沒有發(fā)生翻譯后修飾的蛋白,翻譯后修飾蛋白會(huì)在特定肽段序列有分子量的增加。在蛋白翻譯后修飾方式的質(zhì)譜分析過程中,蛋白會(huì)首先被酶切成肽段,然后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析;通過質(zhì)譜分析,得到的是一系列肽段的相對分子質(zhì)量信息。對于某一個(gè)特定的肽段而言,在沒有發(fā)生任何翻譯后修飾的情況下其序列信息和分子量是確定的,當(dāng)它發(fā)生了某種翻譯后修飾之后,例如磷酸化修飾,因?yàn)榱姿岣姆肿恿恳彩谴_定的,所以在質(zhì)譜檢測過程中如果發(fā)現(xiàn)部分肽段的分子量剛好增加了一個(gè)磷酸根的分子量,則可以假設(shè)這個(gè)肽段發(fā)生了磷酸化修飾,再通過二級或多級質(zhì)譜的譜圖進(jìn)行二次確認(rèn)即可實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾類型鑒定及修飾位點(diǎn)分析等。
蛋白質(zhì)糖基化修飾組學(xué)技術(shù):糖基化是在酶的控制下,蛋白質(zhì)或脂質(zhì)附加上糖類的過程,發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等部位。在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì),和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合。蛋白質(zhì)經(jīng)過糖基化作用,形成糖蛋白。糖基化是對蛋白的重要的修飾作用,有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能作用。凝素親和法是目前糖蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用普遍的分離富集方法。凝集素(lectin)是一類糖結(jié)合蛋白質(zhì),能專一識(shí)別某一特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中特定的糖基序列而與之結(jié)合,它們與糖鏈可逆非共價(jià)結(jié)合,糖蛋白或糖肽被凝集素捕獲之后,通常用特定的單糖通過競爭結(jié)合凝集素將糖蛋白或糖肽洗脫下來。蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后利用凝集素(lectin)富集N-糖基化肽段,然后用N-糖酰胺酶(PNGase)在H218O中切除連接在天冬酰胺殘基(Asn)上的糖鏈。蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)具有全方面性。
蛋白質(zhì)乙?;揎椊M學(xué)定量分析:1. SILAC細(xì)胞標(biāo)記,組織/細(xì)胞破碎,提取、提純目的蛋白質(zhì)(基于SILAC的乙酰化修飾組學(xué)定量)。2. 使用胰蛋白酶將目的蛋白酶解成多肽片段。3. 對多肽片段進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記(基于iTRAQ的乙酰化修飾組學(xué)定量)。4. 使用高效特異性乙?;贵w對乙酰化修飾肽段進(jìn)行免疫富集。5. 使用LC-MS/MS對富集的乙?;亩芜M(jìn)行序列分析。6. 數(shù)據(jù)分析,比對不同樣本中蛋白乙?;揎椝讲町?,并對產(chǎn)生變化的生物學(xué)意義進(jìn)行解釋。質(zhì)譜可以分辨蛋白質(zhì)修飾前和修飾后分子量上的變化。南京蛋白質(zhì)丙?;揎椊M學(xué)質(zhì)譜鑒定
蛋白質(zhì)修飾可檢測修飾類型有磷酸化、糖基化、乙?;⒎核鼗?、丙酰化、丁?;?、丙二?;?jì)南磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)
翻譯后修飾蛋白組學(xué)分析:在蛋白翻譯后修飾方式的鑒定過程中,蛋白會(huì)首先被酶切成肽段,然后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析。通過質(zhì)譜分析,得到的是一系列肽段的分子質(zhì)量信息。對于某一個(gè)特定肽段而言,在沒有發(fā)生任何翻譯后修飾的情況下,其序列信息和分子量是確定的。當(dāng)它發(fā)生了某種翻譯后修飾之后,例如磷酸化修飾,由于序列信息和分子量是確定的,磷酸根的分子量也是確定的。在質(zhì)譜檢測過程中發(fā)現(xiàn)其中的部分肽段的分子量剛好增加了一個(gè)磷酸根的分子量,假設(shè)這個(gè)肽段就發(fā)生了磷酸化修飾,再通過二級質(zhì)譜圖進(jìn)行二次確認(rèn)。濟(jì)南磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)
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