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質(zhì)譜分析蛋白翻譯后修飾原理:相較于沒有發(fā)生翻譯后修飾的蛋白,翻譯后修飾蛋白會在特定肽段序列有分子量的增加。在蛋白翻譯后修飾方式的質(zhì)譜分析過程中,蛋白會首先被酶切成肽段,然后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析;通過質(zhì)譜分析,得到的是一系列肽段的相對分子質(zhì)量信息。對于某一個特定的肽段而言,在沒有發(fā)生任何翻譯后修飾的情況下其序列信息和分子量是確定的,當(dāng)它發(fā)生了某種翻譯后修飾之后,例如磷酸化修飾,因?yàn)榱姿岣姆肿恿恳彩谴_定的,所以在質(zhì)譜檢測過程中如果發(fā)現(xiàn)部分肽段的分子量剛好增加了一個磷酸根的分子量,則可以假設(shè)這個肽段發(fā)生了磷酸化修飾,再通過二級或多級質(zhì)譜的譜圖進(jìn)行二次確認(rèn)即可實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾類型鑒定及修飾位點(diǎn)分析等。泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾。山東乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)服務(wù)
翻譯后修飾蛋白的檢測方法:翻譯后修飾蛋白的檢測技術(shù)包括有免疫沉淀、western blot、質(zhì)譜技術(shù)、體外生化分析等。其中,免疫沉淀是大多數(shù)翻譯后修飾檢測中的關(guān)鍵步驟,它利用蛋白特異性抗體或某種翻譯后修飾的特異性抗體來富集目標(biāo)蛋白,之后再用western blot或質(zhì)譜技術(shù)分析目標(biāo)蛋白。Western blot和質(zhì)譜技術(shù)均可用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的下游檢測,其中Western blot相對簡單但依賴于特異性抗體且無法識別單個蛋白質(zhì)變化,質(zhì)譜則可以檢測包括未知PTM在內(nèi)的幾乎所有的PTMs但成本更高需要專業(yè)知識來分析產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)。研究人員可以根據(jù)成本、有無可用抗體,以及有沒有目標(biāo)等選擇合適的方法進(jìn)行檢測。河南糖基化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)主要方式蛋白質(zhì)磷酸化修飾的免疫印跡技術(shù)優(yōu)點(diǎn):能夠特異鑒定單個磷酸化位點(diǎn)。
蛋白質(zhì)學(xué)組翻譯后修飾自下而上分析策略:常用的糖蛋白分離和富集技術(shù)有:a. 凝集素親和技術(shù);b. 肼化學(xué)富集;c. 親水性相互作用色譜法;d. β-消除/邁克爾加成反應(yīng)。基于質(zhì)譜的糖蛋白鑒定和糖基化位點(diǎn)測定方法有:a. PNGase F酶法;b. Endo H酶法;c. 三氟甲烷磺酸(TFMS)法。泛素化:泛素是一種由76個氨基酸組成的多肽,在真核生物中高度保守,可通過異肽鍵與目標(biāo)蛋白賴氨酸殘基的氨基進(jìn)行共價連接。泛素化蛋白的富集主要基于標(biāo)記,泛素用親和標(biāo)簽(通常為6xHis)進(jìn)行標(biāo)記,并通過鎳螯合色譜親和提取泛素化蛋白。由于泛素的C端為Arg-Gly-Gly結(jié)構(gòu),經(jīng)胰蛋白酶水解后,Gly-Gly保留在修飾蛋白的肽鏈上,使肽的質(zhì)量增加114,因此可作為泛素定位位點(diǎn)的質(zhì)量標(biāo)記。用HPLC對樣品進(jìn)行預(yù)分離,使用針對特定殘留結(jié)構(gòu)的抗體富集泛素化肽,可很大程度上提高泛素化蛋白的濃度。串聯(lián)質(zhì)譜可以鑒定泛素化位點(diǎn)。
蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學(xué):血漿蛋白糖基化修飾分析:蛋白質(zhì)糖基化指碳水化合物通過共翻譯或翻譯后修飾的方式附著到蛋白質(zhì)上的過程,是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。分泌的細(xì)胞外蛋白常被糖基化,糖基化蛋白通常是重要的整合膜蛋白。血漿中的蛋白質(zhì)包括維持機(jī)體正常生理狀態(tài)的蛋白質(zhì)和機(jī)體分泌、滲漏、脫落的蛋白質(zhì),其中不乏存在一些糖基化蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)糖基化修飾不只影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運(yùn)輸和定位,而且在分子識別、細(xì)胞通信、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等特定生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此對血漿蛋白糖基化進(jìn)行分析,有助于研究血漿蛋白的生理功能等。質(zhì)譜是蛋白質(zhì)翻譯后修飾檢測的常用技術(shù)之一。
蛋白質(zhì)有哪些翻譯后修飾?作用機(jī)制和生物學(xué)功能是什么?前體蛋白是沒有活性的,常常要進(jìn)行一個系列的翻譯后加工,才能成為具有功能的成熟蛋白。加工的類型是多種多樣的,一般分為以下幾種:N-端fMet或Met的切除、二硫鍵的形成、化學(xué)修飾和剪切。當(dāng)合成蛋白質(zhì)時,20種不同的氨基酸會組合成為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的翻譯后蛋白質(zhì)其他的生物化學(xué)官能團(tuán)(如醋酸鹽、磷酸鹽、不同的脂類及碳水化合物)會附在蛋白質(zhì)上從而改變蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì),或是造成結(jié)構(gòu)的改變(如建立雙硫鍵),來擴(kuò)闊蛋白質(zhì)的功能。再者,酶可以從蛋白質(zhì)的N末端移除氨基酸,或從中間將肽鏈剪開。舉例來說,胰島素它會在建立雙硫鍵后被剪開兩次,并在鏈的中間移走多肽前體,而形成的蛋白質(zhì)包含了兩條以雙硫鍵連接的多肽鏈。乙?;揎検窃撕驼婧松锼灿械囊环N翻譯后修飾類型。河南糖基化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)主要方式
蛋白質(zhì)修飾可檢測修飾類型有磷酸化、糖基化、乙?;?、泛素化、丙?;?、丁?;?、丙二?;?。山東乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)服務(wù)
蛋白質(zhì)泛素化修飾組學(xué)技術(shù):泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)了真核生物體內(nèi)80%~85%的蛋白質(zhì)降解。此外,泛素化修飾還可以直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位,調(diào)控包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復(fù)以及免疫應(yīng)答等在內(nèi)的多種細(xì)胞活動。樣品要求:1、SDS-PAGE條帶:5個以上可見考染條帶。2、溶液(目標(biāo)蛋白質(zhì)):目標(biāo)蛋白總量>50μg,目標(biāo)蛋白濃度>80%。3、溶液(大規(guī)?;旌系鞍踪|(zhì)):蛋白總量>1mg,蛋白濃度>1μg/μl。山東乙酰化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)
上海拜譜生物科技有限公司位于東川路555號丙樓1171室。拜譜生物致力于為客戶提供良好的多組學(xué)服務(wù),質(zhì)譜檢測,蛋白質(zhì)組學(xué),代謝組學(xué),一切以用戶需求為中心,深受廣大客戶的歡迎。公司將不斷增強(qiáng)企業(yè)重點(diǎn)競爭力,努力學(xué)習(xí)行業(yè)知識,遵守行業(yè)規(guī)范,植根于商務(wù)服務(wù)行業(yè)的發(fā)展。拜譜生物立足于全國市場,依托強(qiáng)大的研發(fā)實(shí)力,融合前沿的技術(shù)理念,飛快響應(yīng)客戶的變化需求。