湖北乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)鑒定

來源: 發(fā)布時間:2022-03-02

蛋白質(zhì)乙?;揎椊M學(xué)定量分析:1. SILAC細胞標(biāo)記,組織/細胞破碎,提取、提純目的蛋白質(zhì)(基于SILAC的乙酰化修飾組學(xué)定量)。2. 使用胰蛋白酶將目的蛋白酶解成多肽片段。3. 對多肽片段進行iTRAQ標(biāo)記(基于iTRAQ的乙?;揎椊M學(xué)定量)。4. 使用高效特異性乙?;贵w對乙酰化修飾肽段進行免疫富集。5. 使用LC-MS/MS對富集的乙?;亩芜M行序列分析。6. 數(shù)據(jù)分析,比對不同樣本中蛋白乙?;揎椝讲町悾Ξa(chǎn)生變化的生物學(xué)意義進行解釋。蛋白質(zhì)翻譯后修飾有什么生物學(xué)意義?湖北乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)鑒定

乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)分析:乙酰化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析是指從蛋白質(zhì)組學(xué)的水平分析蛋白質(zhì)乙?;揎棧ㄒ阴;鞍踪|(zhì)的鑒定和定量。提供基于質(zhì)譜的乙?;鞍捉M研究服務(wù)。蛋白質(zhì)乙?;ńM蛋白乙?;头墙M蛋白乙酰化。組蛋白乙?;饕琴嚢彼嵋阴;?,已在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用方面被普遍的研究。非組蛋白乙?;瘶?gòu)成了哺乳動物細胞中乙?;鞍椎闹饕糠?,參與了所有主要生物過程,包括蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移、功能和降解,遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等。除了重要的生物學(xué)功能以外,乙?;鞍踪|(zhì)及其調(diào)控酶還與衰老和多種疾?。ㄈ缟窠?jīng)變形紊亂、心血管疾病等)緊密相關(guān)。因此,對乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組進行研究有助于進一步探索細胞的生命活動與了解相關(guān)疾病的發(fā)病機制。貴州棕櫚?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)糖基化指碳水化合物通過共翻譯或翻譯后修飾的方式附著到蛋白質(zhì)上的過程。

質(zhì)譜分析乙?;鞍踪|(zhì)組:質(zhì)譜分析技術(shù)可以對蛋白質(zhì)組中的乙?;鞍走M行鑒定、乙酰化位點定位以及定量。當(dāng)質(zhì)譜用于乙酰化定量蛋白組研究中時,因為乙?;鞍踪|(zhì)在生物樣本中含量低、動態(tài)范圍廣,需要先對乙?;亩芜M行富集,然后再對富集得到的乙?;亩螛悠愤M行定量分析。質(zhì)譜定量乙?;鞍捉M采用肽段預(yù)分離降低高豐度蛋白的影響,結(jié)合免疫共沉淀通過高效的抗體富集乙?;碾亩?,從而實現(xiàn)大規(guī)模乙?;蔫b定及定量。為了鑒定和定量更多的乙酰化肽段,在酶切過程中還可使用多種不同的酶對蛋白樣品進行酶切。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾在蛋白質(zhì)中磷酸化位點分析時應(yīng)該注意些什么問題?覆蓋率:覆蓋率越高,檢測和鑒定含有修飾基團的肽幾率就越大。修飾位點的占有率:被修飾的蛋白質(zhì)的百分比低,則檢測到修飾肽的機會會隨之減少。如果百分比較高(> 30%),則有助于識別修飾位點。棕櫚?;鞍仔揎椯|(zhì)譜鑒定方法:S-棕櫚?;闹饕δ苁谴龠M蛋白質(zhì)與細胞膜的結(jié)合。蛋白質(zhì)可以由一個棕櫚?;M成,也可以與更多棕櫚基或與其他脂質(zhì),如豆蔻?;S捎趯-棕櫚?;鞍追治鋈匀痪哂刑魬?zhàn)性,由于S-棕櫚酰化修飾蛋白亞水平以及疏水性和潛在不穩(wěn)定的硫代質(zhì)鏈的S-脂?;摹,F(xiàn)在常用的幾種方法可以捕獲S-脂酰化蛋白以及對目標(biāo)修飾蛋白進行捕獲。蛋白質(zhì)磷酸化修飾鑒定方法有免疫印跡技術(shù)。

蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)技術(shù)優(yōu)點:1、全方面性:磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)以整個細胞蛋白為研究對象,研究內(nèi)容包括了細胞內(nèi)具有生命功能的蛋白,如細胞增生、細胞分裂和細胞分化等相關(guān)蛋白,因而研究更為全方面。2、可靠性:傳統(tǒng)的生物學(xué)研究蛋白質(zhì)磷酸化往往針對特定條件,以兩個蛋白或更多蛋白之間的相互作用為出發(fā)點,具有局限性,缺乏整體認識。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)則可檢測不同蛋白激酶及磷酸化酶對同一個蛋白磷酸化程度的影響,因而結(jié)果具有普遍性和可靠性。3、有效性:磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)反映的是細胞內(nèi)真實發(fā)生的事件,在一次試驗中考慮了不同變量,克服了生物學(xué)中逐步添加變量的缺陷。4、探索性:磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)以細胞內(nèi)蛋白為研究對象,相對于傳統(tǒng)的生物學(xué)研究以及蛋白質(zhì)芯片,更易發(fā)現(xiàn)未知的新磷酸化位點和磷酸化蛋白質(zhì)。如果可以聯(lián)合生物學(xué)技術(shù),則可以發(fā)現(xiàn)具有磷酸化或者去磷酸化功能的酶。乙?;揎検求w內(nèi)保守的可逆轉(zhuǎn)的蛋白修飾。湖北乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)鑒定

蛋白質(zhì)磷酸化修飾的免疫印跡技術(shù)優(yōu)點:檢測特異性高。湖北乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)鑒定

蛋白質(zhì)乙?;揎楄b定流程:1. 組織/細胞破碎,提取、提純目的蛋白質(zhì)。2. 使用胰蛋白酶將目的蛋白酶解成多肽片段。3. 使用高效特異性乙酰化抗體對乙?;揎楇亩芜M行免疫富集。4. 使用LC-MS/MS對富集的乙?;亩芜M行鑒定分析。5. 數(shù)據(jù)分析,并對鑒定的乙?;稽c的生物學(xué)功能進行解釋預(yù)測。隨著蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展,我們越來越深刻地意識到,對于生物體生命活動的管理和調(diào)控過程,密切相關(guān)的不只是單個蛋白質(zhì)層面的修飾狀態(tài),更重要的是研究蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究在翻譯后修飾的動態(tài)變化。高質(zhì)、高效的蛋白質(zhì)翻譯后修飾富集技術(shù)和豐富的、準(zhǔn)確的定量手段使得研究蛋白質(zhì)水平的翻譯后修飾組學(xué)成為現(xiàn)實,借助這些組學(xué)研究手段能夠?qū)崿F(xiàn)不同生理病理狀態(tài)下生物樣本在翻譯后修飾水平上的定量比較,深入地揭示翻譯后修飾水平的波動與生物生命活動的密切聯(lián)系。湖北乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)鑒定

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