蛋白質(zhì)學(xué)組翻譯后修飾的研究策略:自中而下:自中而下的分析方法是自下而上分析方法的一種替代方法,分析組蛋白時其原理類似于自下而上分析策略。在使用這種分析方法時,通常需要將被檢測蛋白質(zhì)消化成3-9kDa范圍內(nèi)的肽段,因此也無法保證檢測到的肽段的完整性。但是,由于儀器的進步和保留了組蛋白尾部的組合修飾,自中而下分析法正逐漸受到歡迎。自中而下更接近于自下而上法的靈敏度。自上而下:自上而下技術(shù)可以直接對完整的蛋白質(zhì)進行測序,包括翻譯后修飾的蛋白質(zhì)和其他大的蛋白質(zhì)片段,而不只是肽段。這可以比較大程度地保留與PTMs相關(guān)的信息,使其適用于組蛋白的全方面表征和分析。自上而下技術(shù)對蛋白質(zhì)的有效分辨率已達到229kDa,一次可以檢測到的蛋白質(zhì)數(shù)量也在增加。蛋白質(zhì)翻譯后修飾可以改變蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)。武漢蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)技術(shù)服務(wù)
蛋白質(zhì)學(xué)組翻譯后修飾的研究策略:目前,有幾種分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾的策略,包括質(zhì)譜(MS)、Eastern blotting、放射性標記和Western blotting。放射性標記和Western blotting是比較傳統(tǒng)、特異性和相對定量的方法。該過程需要事先知道翻譯后修飾類型。局限性包括抗體的特異性和可用性。質(zhì)譜技術(shù)也常被用于翻譯后修飾分析,不受修飾類型和相關(guān)修飾位點的現(xiàn)有知識的限制。自下而上:自下而上的技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中使用的質(zhì)譜策略之一。在根據(jù)序列鑒定肽之前,需要使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)。由于該技術(shù)不能保證在檢測過程中被檢測肽的完整性和穩(wěn)定性,因此無法獲得不同蛋白質(zhì)翻譯后修飾之間關(guān)系的信息,這意味著它無法檢測到某些修飾。因此,該方法不適用于分析組蛋白的組合翻譯后修飾。武漢蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)技術(shù)服務(wù)蛋白質(zhì)有哪些翻譯后修飾?
蛋白質(zhì)磷酸化修飾類型:根據(jù)磷酸氨基酸殘基的不同,可將磷酸化蛋白質(zhì)分為4類,即O-磷酸鹽蛋白質(zhì)、N-磷酸鹽蛋白質(zhì)、?;姿猁}蛋白質(zhì)和S-磷酸鹽蛋白質(zhì)。1、O-磷酸鹽蛋白質(zhì)通過羥氨基酸(如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸)的磷酸化形成。2、 N-磷酸鹽蛋白質(zhì)通過精氨酸、賴氨酸或組氨酸的磷酸化形成。3、 ?;姿猁}蛋白質(zhì)通過天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成。4、 S-磷酸鹽蛋白質(zhì)通過半胱氨酸磷酸化形成。蛋白質(zhì)磷酸化修飾鑒定方法:免疫印跡技術(shù)是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的、根據(jù)特定抗原-抗體的特異性反應(yīng)來檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白質(zhì)的免疫生化分析方法。
蛋白質(zhì)乙?;揎椊M學(xué)定量分析:1. SILAC細胞標記,組織/細胞破碎,提取、提純目的蛋白質(zhì)(基于SILAC的乙?;揎椊M學(xué)定量)。2. 使用胰蛋白酶將目的蛋白酶解成多肽片段。3. 對多肽片段進行iTRAQ標記(基于iTRAQ的乙酰化修飾組學(xué)定量)。4. 使用高效特異性乙?;贵w對乙?;揎楇亩芜M行免疫富集。5. 使用LC-MS/MS對富集的乙?;亩芜M行序列分析。6. 數(shù)據(jù)分析,比對不同樣本中蛋白乙?;揎椝讲町?,并對產(chǎn)生變化的生物學(xué)意義進行解釋。蛋白質(zhì)翻譯后修飾在蛋白質(zhì)中磷酸化位點分析時應(yīng)該注意些什么問題?
蛋白質(zhì)修飾位點分析:基于LC-MS/MS分析能夠精確測定蛋白質(zhì)或多肽分子質(zhì)量這一特性,從而檢測蛋白質(zhì)或者多肽上位點發(fā)生何種修飾??蓹z測修飾類型如下: 磷酸化、糖基化、乙?;⒎核鼗?、丙?;?、丁?;⒈;⑽於;?、琥珀?;渭谆?、二甲基化、三甲基化。1、磷酸化:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期、生長發(fā)育機理等;2、糖基化:蛋白質(zhì)折疊、更新以及免疫應(yīng)答等;3、乙?;夯虮磉_調(diào)控、細胞凋亡、細胞代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以及神經(jīng)退行性的病變等;4、泛素化:細胞周期、細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等;5、甲基化:染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等;6、丙?;?/ 丙二酰化 / 戊二?;?/ 琥珀?;褐饕嬖谟诰€粒體和細菌中,與代謝過程密切相關(guān)。蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)具有全方面性。南京蛋白質(zhì)糖基化修飾組學(xué)分析方法
乙?;揎棇毎藘?nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的刺激有著非常重要的作用。武漢蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)技術(shù)服務(wù)
乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)分析:乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)分析是指從蛋白質(zhì)組學(xué)的水平分析蛋白質(zhì)乙酰化修飾,包括乙?;鞍踪|(zhì)的鑒定和定量。提供基于質(zhì)譜的乙?;鞍捉M研究服務(wù)。蛋白質(zhì)乙?;ńM蛋白乙?;头墙M蛋白乙酰化。組蛋白乙?;饕琴嚢彼嵋阴;?,已在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用方面被普遍的研究。非組蛋白乙?;瘶?gòu)成了哺乳動物細胞中乙?;鞍椎闹饕糠?,參與了所有主要生物過程,包括蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移、功能和降解,遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等。除了重要的生物學(xué)功能以外,乙?;鞍踪|(zhì)及其調(diào)控酶還與衰老和多種疾病(如神經(jīng)變形紊亂、心血管疾病等)緊密相關(guān)。因此,對乙?;揎椀鞍踪|(zhì)組進行研究有助于進一步探索細胞的生命活動與了解相關(guān)疾病的發(fā)病機制。武漢蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)技術(shù)服務(wù)
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