杭州丙酰化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究

蛋白磷酸化檢測(cè)方法：一、Western Blot檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)：1. WB方法簡(jiǎn)便，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室具備Western Blot設(shè)備條件。2. 許多磷酸化抗體十分靈敏，能夠檢測(cè)低至10ug的蛋白樣品。3. 對(duì)于豐度低的蛋白，可以先通過(guò)IP使用目標(biāo)蛋白的抗體對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行富集，再進(jìn)行WB檢測(cè)被磷酸化的蛋白，檢測(cè)效率可以提高幾倍甚至幾十倍。二、質(zhì)譜檢測(cè)方法：Western Blot的方法雖然簡(jiǎn)便，但是對(duì)于大規(guī)模分析復(fù)雜的生物樣品的磷酸化水平就不再適用了。而質(zhì)譜卻能很好的解決這一問題。依靠高準(zhǔn)確度質(zhì)譜儀，如今快速準(zhǔn)確分析細(xì)胞中高豐度蛋白的磷酸化修飾已是非常簡(jiǎn)單的事。具體的檢測(cè)方法為先通過(guò)SDS-PAGE膠，或者2D-PAGE膠等分離目標(biāo)蛋白，將含有目標(biāo)蛋白的條帶切下，胰酶消化，LC-MS/MS檢測(cè)分析蛋白序列和相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化修飾。這個(gè)方法適用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)蛋白的磷酸化水平。蛋白磷酸化修飾過(guò)程是通過(guò)蛋白激酶催化，將磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到多肽底物的絲氨酸、或酪氨酸殘基上。杭州丙酰化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究

蛋白質(zhì)學(xué)組翻譯后修飾自下而上分析策略：常用的糖蛋白分離和富集技術(shù)有：a. 凝集素親和技術(shù)；b. 肼化學(xué)富集；c. 親水性相互作用色譜法；d. β-消除/邁克爾加成反應(yīng)?；谫|(zhì)譜的糖蛋白鑒定和糖基化位點(diǎn)測(cè)定方法有：a. PNGase F酶法；b. Endo H酶法；c. 三氟甲烷磺酸(TFMS)法。泛素化：泛素是一種由76個(gè)氨基酸組成的多肽，在真核生物中高度保守，可通過(guò)異肽鍵與目標(biāo)蛋白賴氨酸殘基的氨基進(jìn)行共價(jià)連接。泛素化蛋白的富集主要基于標(biāo)記，泛素用親和標(biāo)簽（通常為6xHis）進(jìn)行標(biāo)記，并通過(guò)鎳螯合色譜親和提取泛素化蛋白。由于泛素的C端為Arg-Gly-Gly結(jié)構(gòu)，經(jīng)胰蛋白酶水解后，Gly-Gly保留在修飾蛋白的肽鏈上，使肽的質(zhì)量增加114，因此可作為泛素定位位點(diǎn)的質(zhì)量標(biāo)記。用HPLC對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)分離，使用針對(duì)特定殘留結(jié)構(gòu)的抗體富集泛素化肽，可很大程度上提高泛素化蛋白的濃度。串聯(lián)質(zhì)譜可以鑒定泛素化位點(diǎn)。江蘇亞硝基化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)價(jià)錢乙酰化修飾是體內(nèi)保守的可逆轉(zhuǎn)的蛋白修飾。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾：蛋白質(zhì)的翻譯后修飾通過(guò)可逆的共價(jià)鍵將小分子或蛋白質(zhì)與底物蛋白質(zhì)上特定的氨基酸結(jié)合，調(diào)控著底物的酶活性、功能以及三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。各種蛋白質(zhì)翻譯后修飾在信號(hào)通路和網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用，翻譯后修飾系統(tǒng)的紊亂將導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法鑒定蛋白質(zhì)翻譯后修飾的位點(diǎn)需要耗費(fèi)大量的資金和時(shí)間，并且酶反應(yīng)的優(yōu)化常常難以實(shí)現(xiàn)。而計(jì)算的方法則能夠快速、準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)酶特異性的底物蛋白質(zhì)及其修飾位點(diǎn)。

蛋白磷酸化修飾過(guò)程：蛋白磷酸化修飾這一過(guò)程是通過(guò)蛋白激酶催化，將磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到多肽底物的絲氨酸、蘇氨酸，或酪氨酸殘基上。并且磷酸化修飾的過(guò)程是可逆的，去磷酸化反應(yīng)由蛋白磷酸酶催化完成。蛋白磷酸化檢測(cè)方法：Western Blot檢測(cè)方法：Western Blot是檢測(cè)蛋白磷酸化水平的常用方法，主要過(guò)程為先利用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后使用特異性識(shí)別磷酸化蛋白的抗體來(lái)鑒定目標(biāo)蛋白的磷酸化水平。只有被磷酸化修飾的蛋白才會(huì)在相應(yīng)分子質(zhì)量的地方顯現(xiàn)特異性蛋白條帶。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的作用主要是改變蛋白質(zhì)的功能。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾有什么生物學(xué)意義？可以使蛋白質(zhì)具有生物活性，可以發(fā)揮相應(yīng)的功能。翻譯是蛋白質(zhì)生物合成（基因表達(dá)中的一部分，基因表達(dá)還包括轉(zhuǎn)錄）過(guò)程中的第二步（轉(zhuǎn)錄為第1步），翻譯是根據(jù)遺傳密碼的中心法則，將成熟的信使RNA分子（由DNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄而生成）中“堿基的排列順序”（核苷酸序列）解碼，并生成對(duì)應(yīng)的特定氨基酸序列的過(guò)程。但也有許多轉(zhuǎn)錄生成的RNA，如轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）和小核RNA（snRNA）等并不被翻譯為氨基酸序列。蛋白質(zhì)翻譯后修飾是指對(duì)翻譯后的蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)加工的過(guò)程。浙江棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)研究

蛋白質(zhì)糖基化是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。杭州丙?；揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)分析研究

蛋白質(zhì)泛素化修飾組學(xué)技術(shù)：泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)了真核生物體內(nèi)80%~85%的蛋白質(zhì)降解。此外，泛素化修飾還可以直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位，調(diào)控包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復(fù)以及免疫應(yīng)答等在內(nèi)的多種細(xì)胞活動(dòng)。樣品要求：1、SDS-PAGE條帶：5個(gè)以上可見考染條帶。2、溶液（目標(biāo)蛋白質(zhì)）：目標(biāo)蛋白總量>50μg，目標(biāo)蛋白濃度>80%。3、溶液（大規(guī)?；旌系鞍踪|(zhì)）：蛋白總量>1mg，蛋白濃度>1μg/μl。杭州丙酰化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究

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