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PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因分析。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。pcr檢測(cè)做不好都有哪些原因？福建高質(zhì)量pcr公司

PCR的臨床應(yīng)用主要用于針對(duì)疾病遺傳病等。PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中**有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對(duì)疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個(gè)病原體存在，PCR就可以檢測(cè)到。一般實(shí)驗(yàn)室也能檢出10~100基因拷貝，而目前病原體抗原檢測(cè)方法一般需要105-7個(gè)病原體才可檢測(cè)到。PCR對(duì)病原體的檢測(cè)解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問(wèn)題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。定量PCR研究資料已表明，病原體數(shù)量與疾病病情的輕重程度、傳染性及針對(duì)效果均有相關(guān)性。許多研究表明，人類免疫缺陷病毒(HIV)后，潛伏期長(zhǎng)短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量相關(guān)；也有研究表明，HIV病毒載量低于一定值時(shí)，沒(méi)有傳染性。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發(fā)現(xiàn)，病毒的數(shù)量與某些藥物的療效相關(guān)。例如，干擾素針對(duì)對(duì)肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有***降低病毒高拷貝的作用。江西什么是pcr怎么樣英瀚斯生物，可承接各類熒光定量pcr檢測(cè)。

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的中心問(wèn)題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見(jiàn)的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。

長(zhǎng)片段PCR通常指擴(kuò)增大于5kb的DNA的片段。長(zhǎng)片段PCR傳統(tǒng)上使用TaqDNA聚合酶（為了快速延伸）和高保真酶（為了準(zhǔn)確度）的混合物。隨著高合成能力、高保真DNA聚合酶的發(fā)明，長(zhǎng)片段PCR現(xiàn)在可在短時(shí)間內(nèi)高準(zhǔn)確性的完成。通過(guò)與一個(gè)強(qiáng)DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合，聚合酶可獲得高擴(kuò)增能力，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增長(zhǎng)片段（如>20kbgDNA的片段）。初次之外，極高保真度（如>100xTaq）可確保長(zhǎng)片段擴(kuò)增的低錯(cuò)誤率。當(dāng)擴(kuò)增>10kb的片段時(shí)，PCR實(shí)驗(yàn)方案可能需要在以下5個(gè)關(guān)鍵位置進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化：確保使用高質(zhì)量、高純度的DNA樣本。如果DNA聚合酶的熱穩(wěn)定較低，使用更多量的DNA聚合酶以彌補(bǔ)多次循環(huán)中的聚合酶活性損失。降低退火和延伸步驟的溫度，以助于引物結(jié)合。適當(dāng)增加PCR步驟的時(shí)間，以促進(jìn)模板DNA的完全分離及引物的結(jié)合。適當(dāng)增加PCR延伸時(shí)間確保目的片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增。英瀚斯生物可承接臨床樣本、動(dòng)物組織、細(xì)胞樣本各類pcr檢測(cè)。

PCR原理:PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過(guò)程每一步的轉(zhuǎn)換是通過(guò)溫度的改變來(lái)控制的。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。DNA模板變性：模板雙鏈DNA?單鏈DNA，94℃。退火：引物＋單鏈DNA?雜交鏈，引物的Tm值。引物的延伸：溫度至70℃左右，TaqDNA聚合酶以4種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物3’末端為起點(diǎn)的5’→3’DNA鏈延伸反應(yīng)，形成新生DNA鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過(guò)變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增。RTpcr和pcr的區(qū)別是什么？山東pcr實(shí)驗(yàn)

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PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的直接PCR（DirectPCR）介紹：直接PCR意指直接從樣本中擴(kuò)增目的DNA，而無(wú)需核酸純化。直接PCR中，在高溫變性階段，諸如細(xì)胞、組織等材料在獨(dú)特的緩沖液中裂解，釋放出DNA。因此這種方法簡(jiǎn)化了PCR實(shí)驗(yàn)流程，減少了動(dòng)手操作的時(shí)間，同時(shí)可避免純化步驟中DNA的損失。推薦具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR擴(kuò)增。細(xì)胞碎片、蛋白、脂質(zhì)和多糖也隨DNA釋放到裂解液中，它們會(huì)抑制PCR反應(yīng)。具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受這些抑制劑，從而使直接PCR成為可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高靈敏度，因此可從未純化樣本中擴(kuò)增微量的DNA。福建高質(zhì)量pcr公司

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