常見的SCPCL-5妥爾油脂肪酸,粗妥爾油(CTO)是硫酸鹽制法制漿廠的副產(chǎn)品。
編碼感興趣的特定分離的多肽的多核苷酸序列將被插入表達載體中并且任選地被可操作地連接至表達控制序列上,該表達控制序列適于在希望的宿主中表達該蛋白質(zhì)??梢酝ㄟ^核苷酸測序、限制性酶切作圖和生物活性多肽在適合的宿主內(nèi)的表達來確認適當?shù)慕M裝。如本領域所熟知的,為了在宿主中獲得轉(zhuǎn)染的高表達水平,可以將該可操作地連接至轉(zhuǎn)錄和翻譯表達控制序列上,這些序列在所選的表達宿主中具有功能性。重組表達載體可以用于擴增和表達編碼特異性新生抗原肽的dna。重組表達載體是可復制的dna構建體,它們具有編碼特異性新生抗原肽或生物等價類似物的合成或cdna衍生的dna片段,這些dna片段被可操作地連接至適合的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件上,這些調(diào)節(jié)元件來源于哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲。
在表達中具有調(diào)節(jié)作用的一種或多種遺傳元件,例如,轉(zhuǎn)錄啟動子或增強子;被轉(zhuǎn)錄成mrna并被翻譯成蛋白質(zhì)的結構或編碼序列;適當?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止序列,如下文所詳述的。這樣的調(diào)節(jié)元件可以包括用于控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列。可以另外摻入通常賦予在宿主中進行復制的能力的復制起點以及有助于識別轉(zhuǎn)化體的選擇。當dna區(qū)域在功能上彼此相關時,將它們可操作地連接。的dna可操作地連接至多肽的dna,如果它被表達為參與多肽的分泌的前體的話;
表達控制序列和表達載體的選擇將取決于宿主的選擇??梢允褂枚喾N多樣的表達宿主/載體組合。用于真核宿主的有用的表達載體包括例如包括來自sv牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒的表達控制序列的載體。用于細菌宿主的有用的表達載體包括已知的細菌質(zhì)粒,諸如來自大腸桿菌的質(zhì)粒包括pcr pbrpmb9及其衍生物,更寬的宿主范圍質(zhì)粒諸如m13和絲狀單鏈dna噬菌體。用于表達多肽的合適的宿主細胞包括處于適當?shù)膯幼拥目刂葡碌脑松?、酵母、昆蟲或高等真核細胞。
高等真核細胞包括建立的哺乳動物來源的細胞系。還可以利用無細胞翻譯系統(tǒng)。還有利地利用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達重組蛋白。
可以進行哺乳動物細胞中的重組蛋白的表達,因為這樣的蛋白質(zhì)通常被正確折疊,適當修飾并且具有功能性。hela以及bhk細胞系。哺乳動物表達載體可以包括非轉(zhuǎn)錄元件諸如復制起點、連接至待表達的上的合適的啟動子和增強子以及其他5’或3’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列和5’或3’非翻譯序列,諸如必要的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點以及轉(zhuǎn)錄終止序列??梢愿鶕?jù)任何合適的方法純化由轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。離心、差別溶解度或通過用于蛋白質(zhì)純化的任何其他標準技術。轉(zhuǎn)移酶等可以附接至蛋白質(zhì)上,以允許通過穿過適當?shù)挠H和柱而容易地純化。還可以使用諸如蛋白水解、核磁共振和x射線晶體學的技術用物理方法表征分離的蛋白質(zhì)。